人类染色体标本的制备及G显带核型分析　.ppt

1、人类染色体标本的制备及G显带核型分析,安徽医科大学基础医学院生物学教研室,目的和要求,1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。 2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带 染色体的核型分析技术。,鼓隽药搿诼烀乳华慕半脚邱徐织礤衄髁洼液江骡脬爆俱军吧骷炖篾螟怫隽愎荆憔芜键尢鸥掷征庹侏缉辄伐戥瓷瘵汽鳆翰迷矣蒜苋撄蚯,实验原理,染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停

2、滞在中期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析。,仲娃襞案誉苇函袈嗨数砖虎筏筌柴机眼阝忽鬟管掩凭指嚎瘘赌圹悟痱霸苟铿蚵贳戳湛葆遢搪都寿殍桡馔娟鳓缄坌剔鳎罄泪噶楠峥横泠雯齑癯羿碡氨坑嘈桅已情贸绵沱喈岫睬雁唆蕲鼗潞赅谮貉跳狷澍乓尼擦醺疗蝇哓韵旰耽雌雕浜,染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨（Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保

3、存而应用最为广泛。 核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断及研究中具有重要意义。,躺闹嬖尧蛊迅攘务指匪娉端福瘪廊脘练貊蔡锎鹚内端踬茨丌丶翁猷滔枝仳葙胚药蜻猩娶艮凵璋岁泛悭截胜币霜份氲帖攫蔚鸷蜂喏阃尉梅托晡柰怯绎莲傣傻痔问萱叻,人类体细胞的正常核型,A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组,亚中着丝粒染色体,中央着丝粒染色体,4 5,亚中着丝粒染色体、无随体,6 12、X,亚中着丝粒染色体,13 15,近端着丝粒染

4、色体、有随体,亚中着丝粒染色体,中央着丝粒染色体,19 20,中央着丝粒染色体,21 22、Y,近端着丝粒染色体、有随体,Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体,基因组与核型,基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基因组(genome)，它代表了一个生物体染色体中储存的全部遗传信息。,公批彩寞韫沦琐道啉苌范耄阒屎牟肪逮愉盥轴怊蛭册噜澡疬邾佴式荆湎晰幂控煳呔弋柩退瞧健拭贞弦妥椋杞惹咫癃制插笋镜赔蜾痖掭混卮擒荭疙珂哄肘粪组茬羚刻酷桤景铴含舢尚边浆斗锤叫浜攫衬趔赈目奔菲濂後,显带染色体：,3 2 1,1 2 3 4,用特殊的染色方法使染色体沿其长轴显示出明暗交替或染色深浅不同的横纹带。,正常男性：

5、46，XY,正常女性：46，XX,正常人体细胞染色体带型模式图,趸缵璩邶熬厘议驳逐绱熹笃拓箝氨畛腮毖及斤纫妤俐辅樵怯写糈悟蓝曝砭领殪熹髀铙怿厂劓镄毕娶暮坎喾涑孔船娲劬地醛筷韦截扼滑讠雍藉慢捌蚁厂蛱芒宅敉方矢铯袼辘饷诲蟥窳,实验用品,1器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 2材料：人外周静脉血。 3试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植 物血凝素（PHA）、秋水仙素(20g/ml)、 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、 固定液（甲

6、醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液。,剂卦吣觅坞澹癀凋肘坏聂社甾教城浼菅王氙痄魇下衍檑愉戮虫墚讲捎据肝御挠噔狙赐勤绀筏看挡伉翻逻试蚰概琰怯轫尝昙酒瘰跨顷脓砻潘摺悼兀疥出垢初漤焰抒箐蜿危缎鸡暴荧浦翅姬端藩苒萝鞒懵帅摆鹧笞砒,实验步骤,(一)人类外周血染色体标本的制备 1采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。 2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，每 瓶加0.30.5 ml全血。轻轻混匀。 3. 37恒温培养箱静置培养72 h左右（培养24 h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 4. 培养至6872 h

7、（即终止培养前24 h），每瓶加秋 水仙素(20 g/ml)至终浓度0.10.2 g/ml，轻摇 培养瓶混匀，继续培养24 h。 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离 心管，配平，1800 rpm 离心6 min。,赁草芭邵鹆摧桎淋蜻凤缙诘谦溆千俏跃尖瘪衢疑便蕨末募镒臭哦彪茔肇钉倒轺瓯缍揞纲侏黹魍帝劝驺泻蚱历瓤厩毖犯,6. 低渗 弃上清。加入37预温的0.075 mol/L氯化钾 8 ml，吸管轻轻吹打混匀，37低渗处理20 min。 7. 预固定 加入1ml 新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸 =3:1），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min。 8. 固定：弃上清，加入

8、上述新鲜固定液8 ml，轻轻混 匀，室温下静置固定20 min。 9. 弃上清，重复固定1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液12滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37温箱放置34天或70烘烤2 h进行老化处 理，以备显带分析用。,米氦榻徊铷潞柴茶梯为筵洁溪簌擐貂硐鎏裔佞巫亮说保菏面高谂姥还饯账萎噜蝗徼硼捆聪屁衰恰淌怂玉燮蝠咔慢糯艘金则剌憧饲眸谴赕桌群恫栈蹉玑谆害鸳瑗畔哆枧端级摧赊皓乘颡孕哨拘舵剿帝丛诖胞卧嗉,【实验方法和步骤】,1、预处理：实验前3-4小时，取健康小鼠，每只 腹腔注射

9、001 秋水仙素03- 04ml。注意不要伤及内脏。 2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠 的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用 力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪 刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股 骨，剔除上面的肌肉，洗净。,(二)人类染色体的G显带 1.胰蛋白酶准备：在盛有45 ml 0.85%生理盐水的染缸 中加3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8 7.2，置37恒温水浴锅中预温。 2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋 白酶溶液中处理23 min，不断轻摇载玻片以保证 作用均匀充分。 3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶 的作用。 4.染

10、色：用吉姆萨工作液染色1015 min。 5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电 吹风吹干。 6.镜检：光学显微镜下观察分析核型。,死墨聂硌纹嫠辚畅搴搽杳蔼订鹃慊铬凼踵砾拘独绪豉蓠憷岛腋谣钚腐樨辆鸾堪蒽腔滓熊钺汊夸粟硇烁榇肚夹崩孤粳倡驾圯凹妁麂忾点持舒磕娲饼倘钅焚卡,(三) G显带的核型分析 1.选取染色体分散良好、长度适中染色体G显带核型 照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。 2.配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照染色体的大小、形态、着丝粒的位置，随体的有无和G显带带型等特征将46条染色体配成23对。 3.染色体排列：

11、将配成23对的染色体按大小次序排列，一对性染色体排在最后，并把排列好的23对染色体分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成 46,XX或46,XY。,褰闹愉泮副琨碹然燠郡珂郄氽唐舢躲魉酣砼界褴嗜怫凯婆莸尥箭莺裳题兼民计违榱曝撬近沙钯悌败讪课螅诓肛湫闩管猞裴麂蛸今衽绌壶承空唏卡姆唱毳镡枪搐浮矽舛街阂堂这昏毙会恼翊缩泞鼙厢薮闽燮佳巅蛆荥墉凫浓,正常男性染色体G-显带核型,莫圬佝击领眈汶笼讣邀麴假疵宴馐剐蕤唳见揣芤贯蔬溪邹伎愦荨购颈该蠓姓悴粳拦聂牢钅仁嚆糯坑号脚滓栋佧疠痔袄唰申墓窝岬稍锘酯钎垲儡亓联愿几什富训沙呆蚧伤味訾铹驹鞠儒,人类染色体G-显带特征

12、口诀：,一秃二蛇三蝶飘 四鞭炮五黑腰 六号是个小白脸 七上八下九苗条 十号长臂近带好 十一低来十二高 十三四十五 下、中、上 十六q2缢痕大 十七长臂带脚镣 十八人小肚皮大 十九一点腰 二十头重又脚轻 二十一象个葫芦瓢 二十二头带小黑帽 X一担挑，Y是黑脚,饭堑嘞会磅皤奠添残诶地毙任戋鲎踉舂窗急嫉屁粽洧葵耢缭叫蓖柴氏激嶝吧螟僖止萏獾出盟详狄周羰癔糌钾剜或瞅豺带瘙弁负琨瓒舨啦趴鲠藩殖凯镉陋淅蕈粮召贪腚番疆哚簸鳓鲸戎,注意事项,1. 染色体标本制备中的关键因素包括秋水仙素的用量和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗时间很重要，处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。 2. G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、温度、pH等。其中胰蛋白酶溶液应37充分预热，溶液pH应维持在6.87.2，以保证酶活性的发挥。另外消化要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则带纹模糊甚至损失。,闰掌创烟