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1、曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立,研究生 导 师 学 院,The establishment of real-time fluorescent quantitative PCR assays for the detection of Aspergillus,2,1. 研究背景 2. 研究目的 3. 实验路线 4. 第一部分 曲霉菌标准株的培养与DNA提取 5. 第二部分 曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价 6. 结果与讨论 7. 全文结论,目 录,3,研究背景,4,研究背景,曲霉菌属(aspergillus )： 属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，好发于免疫低下及缺陷的人群 在

2、免疫缺陷、恶性肿瘤、器官移植 患者中的感染率呈上升趋势,Yu Y,Am Jperinatol,2013 Mellado E. Rev lberoam Micol,2013 Armstrong-James D. Trends in microbiology, 2014 Kauffman C A. Fungal infections. 2013,研究背景,地方性真菌1%,地方性真菌3.5%,1990年-1999年,2000年-2008年,leukemia patients,M.D. Anderson Cancer center ,CID,2010,50:405-15 杨尚伦. 急性淋巴细胞白血病真

3、菌感染临床特点分析J. 实用癌症志, 2014(9):1182-1184.,2008年-2013年,6,研究背景,侵袭性曲霉菌病（Invasive Aspergillosis, IA）：是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病 最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌 土曲霉菌、黑曲霉菌,Arvanitis M. Clinical Infectious Diseases, 2015 Kwon-Chung KJ. PLoS Pathog .2013,7,研究背景,曲霉菌辅助检查方法,直接涂片和培养 阳性率低,取材有创、困难,真菌感染诊断的研究热点,缺乏特异性，特征性表现出现晚,灵敏性、特异性高，但易受

4、影响，出现假阳性及假阴性,FQ-PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟 目前没有标准的用于临床的曲霉菌FQ-PCR检测试剂盒（CFDA检索） 前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系,8,研究背景,LauA Methods Mol Biol,2013 Aittakorpi A. Journal of clinical microbiology, 2012,建立曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系 ，关键在于曲霉菌DNA的提取和特异性引物探针的设计,研究背景,10,研究背景,曲霉菌DNA提取方法,史俊艳. 临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究D. 中国协和

5、医科大学, 2010. Klimek-Ochab M. Folia Microbiologica, 2011,11,研究背景,曲霉菌DNA提取方法的选取,物理方法,液氮研磨法：次之，已有商品化试剂盒,玻璃珠机研磨法：最佳，但耗时长,超声波降解法,化学方法,CTAB缓冲液加微波法,酶消化法：快速有效,高渗震扰法,Klimek-Ochab M. Folia Microbiologica, 2011 Rittenour W R. Journal of Environmental Monitoring, 2012 OConnor L. US20110311969P. 2011,研究背景,Gade L,

6、 Eukaryot Cell, 2013 Ogawa M. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2012 Robinson S L.Mycologia, 2012 Yuquan X. Applied & Environmental Microbiology, 2013,扩增靶序列的选取,1.探针不保守 2.引物Tm值不达要求,13,初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种2套）,研究背景,14,研究目的,课题来源,湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究,湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童

7、血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究,湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究,湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究,16,实验线路,曲霉菌标准株的接种及培养,制备提取DNA的标本,200mg左右的固体组织,105 个孢子/ml的混悬液,液氮研磨法,一步结合加热法,下载曲霉菌特异性序列,设计引物探针并Blast对比,筛选引物探针,建立的荧光定量PCR检测体系，并进行重复性、特异性、灵敏性评估,1.分光光度计进行比较 2.荧光定量PCR进行比较,引物探针送上海合成,18,第一部分

8、 曲霉菌标准株的培养与 DNA提取方法的比较,19,材料与方法,实验材料,实验菌株 真菌标准株：烟曲霉(CGMCC3.5305)、黄曲霉(CGMCC3.5306)、土曲霉(CGMCC3.4341)、黑曲霉(CGMCC3.4335)购买于中国通微生物菌种保藏管理中心 主要试剂 一步法结合加热法DNA提取试剂盒：湖南圣湘生物有限公司 E.Z.N.A. TM Fungal DNA Mini Kit(真菌DNA提取试剂盒)：OMEGA公司,20,实验方法,1.SDA培养基培养曲霉菌 2.制备DNA提取标本及提取DNA 3.分光光度计检测两种方法的DNA浓度及OD值 4.荧光定量PCR比较两种方法，观察

9、曲线 5.利用SPSS19.0统计软件分析不同方法提取DNA扩增的效果,21,22,实验结果与讨论,23,不同曲霉菌在SDA培养基上生长形态,烟曲霉菌,黄曲霉菌,土曲霉菌,黑曲霉菌,结果与讨论：1.曲霉菌的培养,24,不同曲霉菌光镜下菌落形态,烟曲霉菌（X100）,黄曲霉菌（X100）,土曲霉菌（X100）,黑曲霉菌（X40）,结果与讨论：1.曲霉菌的培养,25,肉眼观察SDA培养基上四种的菌落形态及颜色,结果与讨论：1.曲霉菌的培养,26,结果与讨论：1.曲霉菌的培养,曲霉菌培养的污染问题,因空气中广泛存在各种霉菌孢子，接种时若培养基长期暴露在空气中，则容易被污染 同时高浓度培养的标准株若孢

10、子纷飞可对实验室造成灾难性的损害，所以曲霉菌的接种及标本的制备必须在至少2级生物安全柜中进行，于接种前紫外灯照射半小时，接种后至少照射2小时,27,表：分光光度计测量液氮研磨法提取的DNA纯度和OD值,注：一步结合加热法提取的DNA量少，低于分光光度计检测的下限，未能检测出OD值，但两者样本的基础组织量不同，不具有可比性,结果与讨论：2.DNA提取方法的比较,28,结果与讨论：2.DNA提取方法的比较,液氮研磨法与一步结合加热法提取DNA行实时荧光定量PCR的比较,液氮研磨法,一步结合加热法,扩增曲线均为“S”型,29,结果与讨论：2.DNA提取方法的比较,两种DNA提取方法Ct值的比较,P0

11、.05，差异无统计学意义，即两种方法提取DNA进行荧光定量PCR检测无明显统计学差异,30,两种DNA提取方法的对比,结果与讨论：DNA提取方法的比较,31,第二部分 曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价,32,材料与方法,33,实验菌株 实验用真菌标准株：多种曲霉菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心 湖南省微生物室提供多种细菌。 湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒、支原体、衣原体、巨细胞病毒、结核菌、EB病毒。 主要试剂 Taq酶、 Tris-HCl EDTA、Buffer、dNTP（0.1mol/L）、MgCl2（1mol/L）、PCR引物和探针,实验材料,34,实验方法,1. 设计引物探针

12、 2. 筛选引物探针 3.PCR扩增产物送检测序 4.培养其他曲霉菌及收集实验室标本评估体系特异性 5.检测体系重复性：采用三种不同浓度的标本，批内：每一浓度同一天重复点样20次，批间：每一浓度连续5天重复点样20次，计算Ct值变异系数（CV），若CV5%，重复性好 6. 灵敏性检测：取102个孢子/ml标准菌株悬浮液按1:1、1:2、1:3的比例稀释进行FQ-PCR,35,实时荧光定量扩增条件：94 C 预变性5min后进入循环， 94 C 15s、57 C 30s ，共45个循环，在每个循环末收集荧光信号。,实时荧光定量PCR反应体系（50ul）,实验方法,36,实验结果与讨论,37,液氮

13、研磨法提取的DNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探针 行实时荧光定量PCR扩增曲线,A.fumigatus引物探针1,A.fumigatus引物探针2,A.flavus引物探针1,A.flavus引物探针2,结果与讨论：1.引物探针的筛选,38,液氮研磨法提取的DNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探针 行实时荧光定量PCR扩增曲线,A.terreus引物探针1,A.terreus引物探针2,A.niger引物探针1,A.niger引物探针2,结果与讨论：1.引物探针的筛选,结果与讨论：1.引物探针的筛选,四种曲霉菌筛选完成的引物探针序列,40,结果与讨论：2.扩增产物测序,普通PCR扩增产物进行电

14、泳分析,四种曲霉菌DNA的特异性序列扩增产物电泳条带清晰、亮度高，无拖带、涂抹带现象，扩增产物长度均约为100bp左右，扩增产物完整性好,41,结果与讨论：2.扩增产物测序,PCR扩增产物送至上海公司测序Blast结果,42,结果与讨论：3.特异性检测,四种曲霉菌FQ-PCR特异性检测,其他曲霉菌、真菌及细菌、人类基因均未见扩增曲线，引物探针特异性好，与其他真菌、细菌、人类基因无交叉反应。,结果与讨论：4.重复性实验,四种曲霉菌批内重复性试验,A.fumigatus,A.flavus,A.terreus,A.niger,结果与讨论：4.重复性实验,批内重复性试验Ct均值与标准差,结果与讨论：4

15、.重复性实验,批间重复性试验Ct均值与标准差,批内、批间重复性试验CV最大值均5%，反应体系重复性好,46,结果与讨论：5.灵敏度检测,四种曲霉菌FQ-PCR灵敏度检测曲线,A.fumigatus,A.flavus,A.terreus,A.niger,不同真菌、每一浓度均可见扩增曲线，且每一种稀释浓度的重复样本扩增比例均大于95%，结果显示灵敏度均为35个孢子/ml,47,全文结论,全文结论,1. 对于曲霉菌属固体组织标本，液氮研磨法提取DNA浓度、纯度高，对于曲霉菌属标准株培养的孢子冲洗标本，一步结合加热法提取曲霉菌DNA操作简单、能有效的运用于实时荧光定量PCR检测。,48,全文结论,2. 成功筛选出烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌引物探针，并建立了曲霉菌实时荧光定量P