农药生物测定及其重要节点.ppt

1、农药的生物测定,一、农药生物测定定义,指在一定条件下利用靶标生物测定其对某些化合物的反应的量度，进而鉴别某种化合物生物活性的基本技术与方法。 研究化合物、靶标生物和反应强度三者关系的一项专门技术。 一般包括室内毒力测定和田间试验,靶标生物：通常指有害生物，包括昆虫、螨类、病菌、杂草、鼠类等。包括这些生物的整体或离体的组织、细胞等。 待测化合物：可以是已经成为农药的化合物，包括杀虫（杀螨）剂、除草剂、杀菌剂、杀鼠剂、杀线虫剂乃至卫生杀虫剂等；也可以是待筛选的化合物（已知物和未知物）。 生物反应：指靶标生物对杀虫、杀菌、除草等作用的反应，可以延伸为凡是干扰破坏有机体正常生长、发育、行为、代谢等效应

2、的反应，如植物生长调节、昆虫生长调节、信息传递物质等。 生物反一般用死亡率、抑制率、反应率等指标来表示。如果有，则这个药物或化合物对靶标生物有生物活性，如果不产生效应，则这个药物或化合物对靶标生物就没有生物活性。,为什么要进行生物测定？ ？,二、农药生物测定的基本内容,（1）供试对象的准备（包括靶标生物的饲养和待测化合物的选择，也包括组织培养、细胞培养、药剂配制、剂量计算等内容）； （2） 生物测定的操作技术与方法（包括室内生测、小区实验和田间药效实验三个方面）； （3）影响农药生物测定的因素分析（药剂、生物体、环境、操作方法）； （4）农药生物测定结果评价与表达（用数理统计的方法得到一个恰当

3、的结果来描述一个效果）。,三、试验设计的基本原则,1、要控制影响因素 上面我们已经大致分析了影响农药生物测定的因素，由于这些因素很多，在不同的因素条件下会产生不同的效果。 设效果为y=a+b1x1+b2x2+b3x3+.bnxn。这样是一个复杂的偏回归关系。这不是我们生物测定的目的，我们的目的是为了寻求生测效果与药剂剂量之间的关系，即y=a+bx 其中，y是死亡率的几率值，而x则为剂量对数。这样很清楚明了。如果不控制其它因素，便无法得到这一回归式。 不过目前,已经有人尝试寻求多元的回归关系,这样可能更切合实际一些。如死亡率与温度、时间等的关系。,2、必须设立对照 设立对照的目的是为了消除自然因

4、素而导致的试虫死亡。对照组有几种情况： 空白对照：即完全不处理或仅以清水处理 溶剂对照：即用不同有效成分的溶剂或乳化剂等作对照 标准药剂对照：标准药剂是指在生产中对某种目标昆虫常用的有效药剂可用之同待测农药相比。 试验时，要根据测定的需要，选择采用的对照。但一般情况下，如果选择标准药剂对照，则还需要选择溶剂对照和空白对照补充。,3、必须设立重复 一个原因：生物测定本身不是针对某一个昆虫，而是对昆虫的群体而言，是指某一个待测群体的综合反应，单个处理不足以反映实际情况。 另一个原因：从生物统计理论上讲，增加重复次数，减少每个重复的生物个体是减少试验误差的一个方法。 第三个原因：有一定的重复便于作精

5、确的统计分析。 一般重复3次，每个处理2050头试虫，田间试验的重复次数以35次为宜。,4、供试的目标昆虫要统一一致（室内毒力测定） 尽量选用农作物害虫。应在同一条件下饲养，或采自田间同一环境条件下，在生理下、发育上应尽量一致。 一般有三个条件：一是易于采集、生产上常见；二是易于饲养，便于获得同一群体；三是繁殖力比较强，可提供大量虫源。 需要注意的是：标准目标昆虫是用来做药剂筛选和毒力指示用的。目标昆虫，则是用来测定某种药剂对其作用效果的昆虫。,四、杀虫剂的生物测定,1、目标昆虫对药剂处理的反应 受药剂种类、剂量、处理时间、处理条件等影响，目标昆虫在生测过程中可表现出不同的反应症状。有长期症状

6、也有短期症状。 (1)生长发育迟缓； (2)繁殖力降低； (3)不能正常蜕皮 (4)出现畸形； (5)击倒：昏倒； (6)中毒：身体扭曲、抖动等 (7)麻痹：没有死，但也没有反应； (8)拒食：常常是由于局部麻痹造成的；另外，拒食也可能与气味、事物的颜色等有关。 (9)死亡：心脏停止跳动-死亡常指个体，指群体则为死亡率-与对照比较，消除误差用校正死亡率。,2、生物效应的表达,(1)毒力：毒力是指药剂本身对不同生物发生直接作用的性质和程度。一般是在相对严格条件下，室内用标准生物测定的药剂对供试生物反应的量度。 (2)药效：是在田间或接近田间的条件下所测定的药剂对生物的作用效果。不同剂型、不同寄主

7、植物、不同有害生物、不同的施药方法以及各种田间环境因素都会影响到药效的大小。,(3)反应率：包括所有出现症状的反应情况（前面介绍的几种情况） 一般都是用死亡率表示； 死亡率%=死虫数/试虫数100% 死亡率从广义上应理解为虫口减退率。死亡率可以是正的，也可以是负的，比如处理后的虫口可以是增加的。 (4)校正死亡率 为了消除自然死亡因素的影响，精确的研究和正规的实验结果报告要采用校正死亡率来表示。校正死亡率的计算可采用生存率，也可采用死亡率，分别如下： 校正死亡率=（处理组死亡率对照组死亡率）/（1对照组死亡率）100% 公式适用范围是对照的自然死亡率在5%-20%之间； 5%以下时，可将处理组

8、死亡率减去自然死亡率即可校正； 20%以上时；则表示该目标昆虫种群不宜供试验用，试验结果不可靠。,(5)致死中量LD50或致死中浓度LC50等 致死中量（median lethal dose ） 杀死供试 昆虫群体内50%的个体所需要的剂量，单位是g/g：微克（药剂重量）/克（昆虫体重），记作LD50 致死中浓度（median lethal concentration） 杀死供试昆虫群体内50%的个体所需要的浓度；单位常用ppm；mg/L, mg/kg (现在一般发表用这个)，记作LC50 致死中时（LT50）或击倒中时（KT50）：在某种剂量或浓度下，杀死或击倒供试昆虫群体50%个体所需要的

9、时间，单位是分钟(min)、或小时(h)、天（d）等。,(6)求LD50 和LC50的方法 国内外目前大多采用机率值分析法求致死中量，根据求得的LD-P线（log剂量与校正死亡率的机率值所画出直线的简称）回归式的方法，可分为作图法和最小二乘法，但现在一般采用计算器和计算机编程的方法直接求得。,在毒力测定中需要表达的结果： (1)求各剂量的对数值; (2)求各剂量的死亡率所对应的机率值 (3)按一定方法求出回归方程Y=a+bx (4)求LD50，坡度b值，相关系数r (5)对回归方程进行卡方检验 (6)求LD50的标准误和95%的置信限。,3、不同作用方式的测定方法 根据杀虫剂进入虫体的部位及途

10、径的不同,杀虫剂毒杀作用的方式可分为：胃毒、触杀、熏蒸、内吸、忌避、拒食、抑制生长发育等方式。 （1）胃毒作用的测定技术 基本原理：是使杀虫剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发生毒杀作用，因此要尽量避免药剂与昆虫体壁接触而产生其它毒杀作用。 a、无限取食法。即目标昆虫可以无限制地取食混有杀虫剂的饲料，不计算目标昆虫实际吞食的药量。此法比较简单，但不能避免其它毒杀作用的影响（实际上也常有触杀作用）。 b、定量取食法。基本原理是使供试目标昆虫按预定杀虫剂的剂量取食，或在供试目标昆虫取食后能准确地测定其含量。主要方法有（经典的）叶片夹毒法，适用于植食性，取食量大的咀嚼式目标昆虫（粘虫、蝗虫、玉米

11、螟、菜青虫等）。,（2）触杀作用的测定技术 触杀作用主要强调药液直接作用于昆虫的体壁而产生毒杀作用的方法，要注意尽量避免药剂从口器或气孔进入虫体。 主要测定方法 直接施药法-喷粉、喷雾、浸渍法以及浸玻片法等 局部施药法-微量点滴法,（3）内吸杀虫作用：凡是可以通过植物根茎叶以及种子等部位渗入植物内部组织，随着植物体液在植株内传导，不妨碍植物的生长发育，而对害虫具有很高毒效的化学物质，称为内吸杀虫剂。昆虫由于受内吸杀虫剂的毒杀作用而致死亡的过程，称之为内吸杀虫作用。 根部内吸（纵向传导）把植株的主根顶端切除插入盛有药液的小玻璃瓶内，其他的侧根置于营养液中培养，并给予光照及正常的温湿度条件，12-

12、24h后在上面接虫，然后观察接虫的反应。 叶内吸（横向传导）部分叶片全面施药，叶片局部施药和叶柄施药。 茎部内吸 用毛笔将药剂定量涂抹到茎部的一定部位，并限定长度和面积。经一定时间在叶片上接虫或摘取叶片饲喂幼虫。 种子内吸法 药剂浸种法（药液量是种子量的两倍）或拌种法而使药剂附着在种子上，将之插入土中。随种子吸收水分而吸收药剂，待幼苗长出真叶后，在其上接虫或采回叶片饲喂昆虫，以测定药剂的内吸杀虫作用。（严格操作，是将表面的药剂洗净，然后凉干后在播种）这种方法也可以测药剂的持效期。,（4）拒食活性的生物测定 选择性取食试验和非选择性取食试验,加有药剂,没有加药,都加有药剂,非选择性拒食试验,选择

13、性拒食试验,五、杀菌剂的生物测定,杀菌剂的生物测定的三个测定系统 第一个测定系统 直接毒力测定 测定系统仅包括病原菌和药剂，主要包括：对孢子萌发、菌丝生长的抑制，这种方法又叫杀菌剂的离体生物测定。缺点是容易漏选一些化合物，因此，不能判断出一种杀菌药剂的实际应用价值。 第二个测定系统 病原菌-药剂-植物 第三个测定系统（杀菌剂的田间试验） 包括药剂寄主植物病原物环境四方面的综合影响. 一般情况下，要想获得一个完整的杀菌剂毒力测定资料，首先应在室内进行，然后再进行温室盆栽测定，最后进行大田药效实验： 室内测定 温室盆栽毒力测定 大田药效试验 （病菌+药剂) （病菌+药剂+植物） （病菌+药剂+植物

14、+环境）,杀菌剂室内毒力的测定方法：即在供试菌直接接触药剂的情况下测定毒力的方法。一般应用药剂+培养基（或其它），可以通过以下几种方式来判断结果 （1）真菌孢子萌发的抑制力-经典的方法 （2）阻碍菌丝生长-生长速率法水平扩散法 （3）抑制菌体增殖（细菌、真菌） 杀菌剂药效的室内测定方法 ：即 药剂与植物部分器官如叶、果、种子等相互结合的一个测定系统。 (1) 叶片接种法 (2) 叶碟漂浮法 杀菌剂温室植物盆栽实验法 利用药剂、病原菌和温室植物三个系统来判断杀菌剂对植物上病原菌的控制效果和植物的保护作用的测定方法，即为杀菌剂温室植株测定法。,抗病毒剂的药效测定(以叶部传染的病害为例) 一般采用烟

15、草花叶病毒(TMV)作为供试毒源 植物采用烟草或者对烟草花叶病毒敏感的植物如菜豆. 采用摩擦接种的方法进行接种(棉球或者刷子) 采用浸渍法或者涂布发进行施药(半叶法) 通过病斑(local lesion)来评判效果,六、除草剂的生物测定,1、除草剂生物测定的定义 除草剂的生物测定技术是指利用生物体（作物试材、杂草试材，主要指有害生物）对除草剂的反应，来测定除草剂的毒性及其效果的基本方法。 其测定系统直接是药剂植物或其它生物体之间的关系。 除草剂的概念是相对的，杂草的概念也是相对的；生物体可指包括鱼类，甚至哺乳动物在内的广泛的概念。,2、除草剂生测的基本原理 利用活的生物体或生物器官，在生长、形

16、态等方面对除草剂的不同反应来确定除草剂的浓度。 对生物体的敏感反应要求： （1）在一定浓度范围内要有一定的敏感性，生物体对除草剂的反映随着浓度的增加而增加； （2）在环境条件相似的情况下，用同一种试材重复试验时，对同种除草剂的反应可以重现。,3、除草剂生物测定参数的选择（或者是活力的鉴定方法）,这些参数即是用来评价除草剂对植物发生作用的一些指标或特点。参数选择的原则：要想评价一种药剂对植物发生作用的影响，应选择对微量药剂敏感，并且有明显的反应指标和容易测量的症状等作为参数。主要包括以下几个方面： (1)种子发芽。种子胚芽比较敏感，而且许多除草剂可抑制敏感种子的发芽及胚根和芽鞘的生长： A. 可

17、通过观察种子的萌发率来测定某种药剂的存在与否。 B. 通过测定幼根或幼小茎叶的生长来精确测定抑制剂量的反应范围。 这种测定简便易行，更适合于易挥发和易淋溶的药剂，但不能测定抑制光合作用的除草剂，因为种子发芽不需要光合作用。,(2)植物生长量的测定。 一般采用称取地上部分的重量来表示，通常有鲜重和干重之分，鲜重经常比干重更有意义，因为枯黄和坏死的植物部分从干重上来说和绿色植物的相当部分是基本相同的，这样就不能很好的反映枯黄和坏死的情况。 (3)生理生化指标的测定。 植物的呼吸作用、光合作用，以及所含成分（蛋白质、色素）或新陈代谢物质的变化都可以作为测定的指标。另外，也可用植株单位时间的耗水量作测

18、定指标：在相同条件下，处理过的植株可以通过其需水量的变化而产生相应的代谢反应。 (4)症状的测定。畸形、白化、黄化等可采用分光光度计来测定颜色的变化。,4、除草剂生物测定结果的表达 (1)一般处理只需用反应相对于对照的百分数来表示。如鲜重、干重、植株、株高等减少的百分数来表示，可套用抑制率=（对照区试材-处理区试材）/对照区试材100%。 (2)比较各处理之间的差异则采用：地上部分鲜重减少50%的药量（CD50）、地上部分干重减少50%的药量（CR50）、株高减少50%的药量（ED50）、覆盖面积减少50%的药量（ND50）、抑制生长50%的药量（DD50）、生物量减少50%的药量等。 (3)

19、对于总的指标也可采用药效指数的办法来评判，将处理整体结果分级：04级，共分成5级。然后，根据药效指数来评判某一个小区处理的效果。可以将各处理的样本都算进去。因为根据每一级的样本数占样本总数的比例可求出小区的总体效果，因而可用来比较药效。 (4)采用国际通行的指标来进行药效评判。,5、除草剂除草活性筛选的方法,1.筛选的主要程序为：实验室初筛盆栽实验田间实验三个步骤。 2.初筛的模子。以高粱法+萝卜子叶法+小球藻法（种子发芽+植株生长量+叶绿素合成量）三种办法连用可检测所有有除草活性的化合物。 标准浓度下的施药浓度为活性试验100ppm，34天后检查药效。盆栽实验中用药150g/亩，23周后检查

20、药效。其指标有三种：株数防除率、鲜重减少率、株高抑制率。 3 .生测试材包括单子叶植物-稗、小麦、高粱； 双子叶植物-油菜、黄瓜、亚麻、萝卜等。 4.活性筛选的内容： (1)活性剂量。 (2)杀草谱。 (3)作用部位与作用特点。 (4)残留量和残效期。 (5)毒性,等等,七、田间试验的基本方法,1、设计试验方案 试验方案是达到试验目的的途径，是完成试验任务的重要前提。完善的试验方案，不仅能提供丰富的信息，而且节省人力物力，可以多快好省地完成试验任务；错误的试验方案，或者试验信息缺乏，或者不能准确的说明问题，甚至导致试验完全失败，浪费人力物力。因此，试验方案设计在试验中占着极其重要的位置，是整个

21、试验的基础。 试验方案要有明确的目的性 试验方案要有严密的可比性 遵循“单一差异原则”除了欲比较研究的因素有差异外，其他因素应相对一致。 设置“对照”即标准处理，是其它处理共同比较的标准。 尽量排除非试验因子的限制作用,2、试验误差的来源和控制方法 试验误差非实验因素引起的差异； 试验误差的来源：作物群体差异，土壤肥力差异，取样不当，小气候差异，取样不当等。 试验误差的控制方法：严格执行各项技术措施，正确取样，设置重复，随机排列等,4、试验取样方法,5、田间试验数据采集,数据采集的方法举例 (1)茶小绿叶蝉：施药前调查虫口基数，使用工农-l6型背负式手摇喷雾器，按设计浓度配药液喷药一次，均匀喷于茶树上至药液欲滴为止，以清水作空白对照。施药前及药后1d、3d、10d调查茶小绿叶蝉成、若虫数量，用5点取样法，每小区查5株。采用盆拍法取