《色谱分离》PPT课件.ppt

1、第二节 色谱术语,1 分配系数与分配比,分配系数 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（g / mL）比，用K 表示。,分配比 k：质量比，又叫容量因子或容量比,分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。,意义： 溶质流过色谱柱时，K大的组份通过色谱柱所需要的时间长，K小的组份需要的时间短。 当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。,2、基线：在实验条件下，色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。 3、峰高：色谱峰顶

2、与基线间的垂直距离，以h表示。 4、保留值： A 死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近： B保留时间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。 C 调整保留时间tr： .,保留时间tr的表达： 时间单位(如s, d, h), 距离单位(如cm)， 体积(ml, l)表示。 tr意义： 色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。,D、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检

3、测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时， VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算： E、保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如右图： F、调整保留体积VR：某组份VR扣除VM后，称该组份的VR ，即,G、相对保留值2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即： 由于2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。 注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s), 然后再

4、求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时r,i 可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号a表示： 式中tr,2为下一峰的调整保留时间，所以这时a总是大于1。,H)、分配比 k, 即容量因子： 意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数 k与m的关系： 5 区域宽度 色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： A、标准差：0.607倍峰高处峰宽的一半。 B、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与的关系为 C、基线宽度Y：色谱两侧拐

5、点上的切线在基线上的截距。,色谱曲线的意义： 色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,两组份完全分离必须满足： A、两组份的分配系数必须有差异； B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度； C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。,6 两种色谱理论 塔板理论热力学因素 速率理论动力学因素,塔板理论的假设： (1) 在每一个塔板上，可以迅速建立分配平衡 (2) 将流动相看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 (4) 每次分配的分配系

6、数相同。,（1） 塔板理论,1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。 半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。,将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。 每一块塔板高(plate high)为H。 假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为

7、： n称为 理论塔板数 (theoretical plate number)。 与精馏塔一样，色谱柱的柱效 随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。,色谱柱长：L， 塔板高度：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,柱效参数： 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高,组分在tM时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：,Y,Y,（2） 速率理论-影响柱效的因素,用速率方程重新定义塔板高度，并提出影响柱效的动力学因素：涡流扩散、分子扩散、传质阻力 速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u + C

8、u H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s),A 涡流扩散项B/u 分子扩散项Cu 传质阻力项,涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n，色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,分子扩散项,B = 2Dg ：弯曲因子， Dg：组分在气相中的扩散系数（cm2s-1）,与组分性质、流速、滞留时间、流动相性质、柱温等因素有关,k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数。 减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,传质阻力项,流动相传质阻力Cg 固定传质阻力CL C =（Cg + CL）,分离度,塔

9、板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：, 柱效高， K(分配系数)较大, 完全分离； K不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离 峰宽，柱效较低，K较大,但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,Y1,Y2,理论塔板数n 增加柱效 ，可提高分离度 r2

10、1 （或选择因子） 增大r21是提高分离度的最有效方法， 容量因子，分配比,影响分离度的因素,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,影响两峰间距,谱定性、定量方法,1.利用纯物质定性的方法 2.利用文献保留值定性 3.与其他分析仪器联用的定性方法,定性方法,定量方法,归一化法 标准曲线法外标法 内标法,第三节 凝胶过滤色谱,一、 原理与操作 定义： 凝胶过滤 (Gelfitration) 即凝胶过滤层析 (Gelfitration Chromatography)， 也称分子排阻层析 (Molecular-Exclusion)、 尺寸排阻 (Size Exclusion)、 分子筛层析 (Molecul

11、ai-Sieve Chromatography) ， 是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。,GFC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。,在层析柱中填充分子筛(凝胶)介质，加入待纯化样品，然后用适当缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。 大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律，其运动轨迹“迂回曲折”。因此，下移速度慢。 所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依

12、次流出，彼此分开。, 凝胶过滤法是一种 Partition 层析法：,样本,固 定 相,流 动 相,小分子 被阻滞,小分子,大分子,Stokes radius 分子大小、 形状,较快流出,分子筛凝胶色谱原理,Size-exclusion chromatography,Desalting proteins 脱盐蛋白,proteins,salts,图示，在装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质的层析柱中，料液中溶质1的相对分子质量很大，不能进入到凝胶的细孔中，因而从凝胶间的床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积； 对子溶质4，其相对分子质量很小，能够进入到凝胶的所有细孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；

13、相对分子质量介于溶质1和溶质4之间的溶质2和3可进入到凝胶的部分细孔中，故其洗脱体积介于空隙体积和柱体积之间，根据相对分子质量的差别（溶质2的相对分子质量大于溶质3）顺序洗脱。相对分子质量大于溶质l和小于溶质4的溶质的洗脱体积分别与溶质1和溶质4相同。,GFC的分离原理及洗脱曲线,GFC操作中溶质的分配系数M只是 相对分子质量、 分子形状、 凝胶结构(孔径分布) 的函数， 与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。 因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocratic elution

14、)。,GFC可分离系统体积介于V0和Vt之间的溶质，分离精度有限，料液处理量也很小，只有当料液体积小于两溶质的洗脱体积差，才有可能完全分离。,（1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。 洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。,二、 凝胶层析的操作,溶胀时不能用电磁搅拌器，这样会使颗粒损坏，产生大量粉末，影响流速。溶胀要完全，否则影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险，加热可使溶

15、胀加速。 溶胀时搅拌可能产生很细的颗粒，必须将其除去，否则会严重降低柱的流速。 琼脂糖凝胶是以浓的悬浮液的形式出售的，不需溶胀。,凝胶层析的操作 （2）装柱 装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。 凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。 床层要均匀，不能有纹路或气泡。 装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。,（3）上样和洗脱 柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样加入至柱的上面，防止扰动 填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。 当样品液面恰与

16、凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。 然后用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。,非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。 pH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。 多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时为了使样品溶液解度增加而使用含盐洗脱剂。,（4）凝胶的再生和保养 理论上因为凝胶本身不与溶质发生作用，所以层析分离后无需再生处理，但实际操作时凝胶层常有一定的污染，必须作适当的处理。 交联葡萄糖凝胶柱

17、可用0.2mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合液处理。 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5mol/L NaCl处理。,为了抑制微生物在凝胶层内生长，在凝胶床保存之前必须完全除去磷酸根离子和所有底物，将柱真空保存或低温保存，但温度不可过低，离子强度要高一些，以防冻结。 经常使用的凝胶以湿态保存为主，只要在其中加入适当的抑菌剂就可放置几个月至一年，不需要干燥。 常用的抑菌剂有： 叠氮钠 （0.02%）、 三氯丁醇 （0.01%0.02%）、 乙基汞硫代水扬酸钠 (0.005%0.01%)、 苯基汞代盐 （包括、苯基汞代乙酸盐、硝酸盐、硼酸盐，0.001%0.0

18、1%）。,三 凝胶过滤介质 凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。因此，良好凝胶过滤介质应满足以下要求： 亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； 具有一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。, 各 种 色 析 胶 体 ：,Pharmacia（法玛西亚 ）,Bio-Rad,Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel,BioGel P BioGel A,glucose (dextrose) agarose glucose + a

19、crylamide cellulose,acrylamide agarose,FPLC,Superose, Superdex Mono Q, Mono S,传统SEC填料 粗、中、细 Sephadex葡聚糖凝胶（瑞典 Pharmacia 公司Amersham） 肽和球蛋白的分离范围G10 -700G15 -1500G25 10005000G50 150030000G75 300080000G100 4000150000 超细4000100000G150 5000300000 超细5000150000G200 5000600000 超细5000250000,Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与N

20、、N-亚甲基双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联的刚性珠体。S-200 5000250,000 S300/400/500/1000Sepharose琼脂糖凝胶2B/4B/6BSepharose CL交联琼脂糖 琼脂糖与2，3-二溴丙醇在强碱性条件下反应而得。,Bio-Gel Bio Rad(美)Bio-Gel A 琼脂糖 P聚丙烯酰胺Superdex 琼脂糖和葡聚糖 TSK-Gel乙烯共聚物 PW2000/2500/3000/4000/5000TSK HW-40/50/55/65/75TSK G4000/3000/2000SW凝胶过滤色谱一般用于原料液的初分离。,Sephadex G是最传统的

21、软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖(右旋糖酐)交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。原料中环氧氯丙烷用量越大，交联度越高，凝胶的网状结构越紧密，吸水量越小。Sephadex凝胶按交联度大小，分G10G200共八种型号。图7-7中曲线表示葡聚糖凝胶骨架。 图7-7交联葡聚糖网状结构 图7-8琼脂糖凝胶结构 琼脂糖凝胶是另一种较常使用的凝胶过滤介质，其骨架结构如图7-8所示。,Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。 Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。除GFC外，琼脂糖凝胶经化学

22、修饰后主要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析的载体。 除上述两种常用的凝胶外，聚丙烯酰胺凝胶也常使用。,常用：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖凝胶、Sephacryl、Superdex等,表征凝胶特性的参数 排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。 分级范围：凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量。 凝胶粒径：粒径越小，HETP越小，分辨率越大。 空隙体积：色谱柱中凝胶之间空隙的体积。 溶胀率： 床体积：1g凝胶干粉充分溶胀后所占有的体积。,影响分离特性的因素 线速度 料液体积,凝胶过滤色谱影响操作的因素,线速度 料液体积,料液浓度 料液与流动相得黏

23、度比小于2，以避免不规则的洗脱曲线（吐舌和拖尾）。 相对分子质量与分配系数的关系 ma-blogMr 凝胶粒径 小粒径凝胶是提供色谱柱效的最佳途径。粒径 ，柱效 ， 分离度 ，分离速度都变大,凝胶层析的应用及特点 分离纯化 GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒(50 nm 400nm)的分离与分析中频繁使用的液相层析法。 GFC还可用于医药产业中无热原水的制备以及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。例如，青霉素的致敏作用般认为是产品中存在的一些高分子杂质所致，如青霉素聚合物和青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合形成的青毒噻唑蛋白，它们都是具有强烈致敏性的抗原。利用Sephadex G25凝胶柱处理青霉素溶液可除去这类高分子杂质,高效GFC分离骨髓血清蛋白质的结果,2脱盐 GFC在分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分于质量物质。例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。,此外，GFC还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合于下一步单元操作的有效实施(例如，某些盐离子抑制蛋白质在