干细胞移植治疗课件.ppt

1、干细胞移植治疗,干细胞 stem cell,幼稚细胞 多向分化潜能(multipotential) 自我更新 (self-renew),干细胞分类,胚胎干细胞 embryonic stem cells 胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。 成体干细胞 adult stem cells 成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为组织干细胞。如神经干细胞、 造血干细胞 、 骨髓间质干细胞、上皮干细胞 、肝干细胞、胰腺干细胞等。,技术突破,人类胚胎干细胞在体外培养成功。 1998年W

2、isconsin大学的James Thomson和Johns Hopkins大学的John Gearhart从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。 成体干细胞的横向分化。 1999年Goodell等人用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞。这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极其有效的治疗作用。,干细胞应用平台技术,技术原理 干细胞充当了分化细胞预备队的角色。

3、干细胞有以下特点： （1）干细胞本身不是处于分化途径的终端。 （2）干细胞能无限的增殖分裂。 （3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 （4）干细胞通过两种方式生长 ，一种是对称分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。,技术方向,凡需要不断产生新的分化细胞以及分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织都要通过干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量生命体是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。 随着基因工程、胚胎工程

4、、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。,干细胞应用前景,细胞治疗 组织工程 药物筛选 发育研究 基因功能研究,细胞治疗cell therapy （干细胞移植）,细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向。 胚胎干细胞和成体干细胞都能用于细胞治疗，但目前只有少数成体干细胞在细胞治疗上己开始取得临床疗效，大多数的干细胞治疗还在实验阶段。,干细胞

5、移植分类,自体移植（AUTO） 无排斥反应 同基因移植(SYN)（同卵孪生之间） 一般无排斥反应 异基因移植（人与人之间骨髓造血干细胞） 同种移植（ALLO） 异种移植 (XENO) 有排斥反应（供、受者组织相容性抗原不同） 需组织配型、选择供者（骨髓库）； 抑制受者的免疫应答、诱导免疫耐受。,我院开展的干细胞治疗项目,化放疗患者治疗前预存干细胞项目 干细胞移植治疗肝硬化项目 干细胞移植治疗肢体缺血性病变项目 干细胞移植治疗骨折不愈合和延迟愈合 干细胞移植治疗糖尿病,基础：溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）,溃疡性结肠炎(UC )是一种原因不明的主要 侵犯结肠黏膜和黏膜下

6、层的炎症性肠病。 以往采用的常规治疗方法为药物治疗。随着医学技术的发展, 干细胞已成为细胞生物学以及整个生命科学的研究热点。,顽固性溃疡性结肠炎,顽固性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）指诱导或维持缓解治疗失败，通常为皮质激素抵抗或依赖的病例 皮质激素抵抗是指泼尼松龙足量（0.75 mgkg- 1d-1）应用4周不缓解者。 皮质激素依赖是指泼尼松龙减量至10 mg/d即无法控制发作（用药3月不能减至10 mg/d以下）或停药后3月复发者。 如何寻找有效的治疗方法成为临床研究的难点和重点。近年来，干细胞的研究为溃疡性结肠炎治疗带来新希望。,干细胞治疗思路,由于溃疡性结肠炎

7、主要以结肠粘膜弥漫性损害（炎症、糜烂、溃疡等）为特点，修复损伤的结肠粘膜是治愈该病的关键。正常情况下，结肠粘膜上皮是机体更新和修复较快的组织。 结肠粘膜的再生和修复依赖于结肠粘膜干细胞。结肠粘膜干细胞位于结肠隐窝的底部（Pull SL，Doherty JM，Mills JC，et al .2005），数量极少，可分化为成熟的结肠粘膜细胞，维持结肠粘膜的生理更新。 溃疡性结肠炎最典型的病理特点是大量隐窝坏死，形成脓肿，而结肠粘膜干细胞位于隐窝基底部。,干细胞治疗思路,结肠粘膜干细胞减少是导致粘膜损伤无法修复的重要原因。 因此，如何补充足够的结肠粘膜干细胞就成为治疗该病的关键。,干细胞来源,增加结

8、肠粘膜干细胞数目可能的途径有以下几种： 第一种方法是分离鉴定成体结肠粘膜干细胞作为患者移植来源。但由于结肠粘膜干细胞缺乏高度特异的标记，分离、培养、鉴定都非常困难，完全依靠直接补充结肠粘膜干细胞在当前是不现实的（StappenbeckTS，Mills JC，Gordon JI.2003）。 第二种是将胚胎干细胞作为结肠粘膜干细胞的来源途径之一，但由于伦理学、免疫排斥和可能发生肿瘤、污染等因素限制了其应用（Hopkins TanneJ.2005） 第三种可能途径就是骨髓干细胞动员（Okamoto R，Yajima T，Yamazaki M，et al .2002）。,干细胞来源,当溃疡性结肠炎隐

9、窝坏死严重导致原本极少的结肠粘膜干细胞大量减少时则无法满足需要。因此，利用骨髓干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子大幅提高循环中的干细胞数量，随血循环到达病变结肠，在结肠微环境中，受诱导进行增殖和转分化为结肠粘膜干细胞和结肠粘膜上皮细胞，增强机体对病损粘膜的修复能力，促进溃疡愈合，恢复其正常的生理功能。 利用自体骨髓干细胞治疗时可不必进行结肠粘膜干细胞（数量少，缺乏特异标志）的分离和扩增，骨髓干细胞的增殖和转分化在结肠组织微环境中可自行完成。 进行自体骨髓干细胞动员治疗溃疡性结肠炎，还将克服异体移植供体来源少和排斥反应的问题，相当于安全、方便的进行了骨髓干细胞的 “自我移植”，临床意义重大，应用前景

10、广阔。,干细胞来源,采用异基因骨髓移植，需要配型、清髓和长期应用免疫抑制剂，风险大，费用昂贵 采用自体骨髓移植，由于溃疡性结肠炎患者往往合并骨髓病变，骨髓干细胞功能差。,干细胞来源,为了避免由于溃疡性结肠炎病变影响骨髓干细胞功能，可选用同种异基因脐带血干细胞作为治疗干细胞的来源，以保证干细胞的质量。 首先，脐带血比骨髓更为原始。 第二，脐带血的干细胞自我繁殖能力最强，繁殖速度最快，骨髓次之，外周血最差。 第三，脐带血中干细胞的比率最大，骨髓次之，外周血最低。外周血中的干细胞更接近终端细胞或叫祖细胞或前体细胞。 第四 脐带血干细胞在用做细胞治疗时可以忽略HLA配型问题，就如同临床上输血一样，不用

11、HLA配型。原因： 脐带血干细胞的表面抗原性很弱，弱到不被受体的免疫系统识别。 用于细胞治疗的脐血干细胞不替代原有的组织器官，原有的组织器官还在起作用。,干细胞种类选择,HSBC 横向分化 免疫重建 MSC 多向分化 免疫调节 组织修复 ESC 全能分化,MSC,间充质干细胞具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。 获得足量的骨髓来源的干细胞-体外增殖。 分离间充质干细胞的方法主要有三种： 全骨髓贴壁培养法 密度梯度离心法 根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行 分选,MSC,常用的是密度梯度离心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、

12、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得MSC的纯度达到90%左右。 间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。 选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。,MSC,间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化。 在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞等。,骨髓干细胞分离MNC处理,骨穿抽60ML骨髓 处理方法 用红细胞裂解剂-

13、离心-洗涤 Percoll分离液梯度离心 “细胞处理试剂盒”负筛选,Percoll分离液梯度离心分离MNS,1 于骨髓中加入10 ml Percoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8 ml DMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。 2 以25003000 r/min，离心30 min后，可见离心管中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。 3 将20 ml PBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r

14、/min离心10 min。 4 弃上清，重复步骤3 5 弃上清，加入5 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。,MSC干细胞的传代,1 当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。 2. 加入0.25%的胰酶2 ml，置于37培养箱中23 min，取出在显微镜下观察，当8090%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。 3. 传代：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入10 ml培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。

15、,MSC冻存,冻存： 加入3 ml DMEM完全培养基终止消化 用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清 加入1 ml冻存液 （FCS ：DMSO：L-DMEM=2：1：7） 吹打混匀，置于冻存管中 4放置 3040 min，-20 放置1 h，-80过夜，再移入液氮罐中。,MSC复苏,复苏： 1)将细胞从液氮中取出，37 轻微摇晃，使细胞快速融化。 2)75酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入5 ml培养基，1000 r/min 离心5 min。 3）弃上清，加入5 ml完全培养基混匀细胞，接种于25 cm2培养瓶中。,细胞处理,“细胞

16、处理试剂盒”是经药监部门批准专门用于临床分离骨髓和脐带血中有核细胞的，其主要成分为蛋白酶和无机盐离子，是一种新型而简便的富集高纯度干细胞的方法，是世界上分离、纯化干细胞最优化的方法之一。 其原理是以蛋白酶选择性地与非靶细胞结合，使非靶细胞表面活性发生变化，细胞密度发生了变化，通过密度梯度离心的方法分离获得所需的靶细胞，由于是负筛选，所以收集的靶细胞没有任何标记。,细胞处理,一个试剂盒设计分离200 mL骨髓或200 mL脐带血，能有效全部除去红细胞、血小板、及去全部血浆物质，LIN抗体阴性，只回收有核细胞，分离纯化后的有核细胞回收率85%以上，细胞存活率98%以上，不损伤干细胞，干细胞表面无任

17、何标记物，能完整地保持干细胞原有的生物学活性。,细胞处理（骨髓间充质干细胞的原代培养 ）,1 用“细胞处理试剂盒” 阴性分选出MNCs 2 将20 ml 生理盐水加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r/min离心10 min。 3 弃上清，重复步骤7。 4 弃上清，加入10 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。 5 每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。,干细胞治疗的途径与方法,清髓法：有研究试用骨髓造血干细胞移植治疗顽固性炎症性肠病取得一定效果。 “清髓性”移植由于采用了大剂量的放/化疗作为预处理方案，使得移植过程存在很大风险， 1 较长时间的严重的造血抑制可引起脑出血、肺出

18、血，以及容易发生细菌/真菌败血症，往往导致患者早期死亡 2 大剂量的放疗（12Gy）不但容易引起放射性肺炎、肝静脉闭塞综合征、白内障等严重并发症，而且会影响到患者的生殖功能，造成年轻患者在移植后不孕不育。 3 移植物免疫抑制发生率高，且程度严重；患者在移植后免疫功能重建缓慢，易反复发生呼吸道感染、皮肤带状疱疹等；这些都严重影响到患者在移植后的生存质量。 4 对于年龄大于45岁、身体虚弱、合并有其他器官功能障碍的患者，应被排除在清髓法移植治疗的对象范围之外。,干细胞治疗的途径与方法,非清髓法：治疗前后不用任何放疗或者化疗措施，直接从骨髓或者脐带血中提取干细胞（总数大于1.0108个），经股动脉插

19、管至肠系膜下动脉，缓慢注入，具有安全、方便、费用低廉等优点。 采用加拿大威尔森公司研制的脐带血干细胞体外分离试剂盒，从脐带血中提取C D 3 4 +、C D 1 1 7 +、CD133+、C-kit+、Sca-1+干细胞（总数大于1.0109个），经股动脉插管至肠系膜下动脉，缓慢注入。,临床疗效,临床初步观察表明，对激素抵抗型溃疡性结肠炎近期可以使患者临床症状缓解，结肠粘膜愈合，组织学改善，疾病活动指数降低，并逐渐停用皮质激素。 无一例出现干细胞治疗相关的并发症 由于脐带血干细胞表面抗原性很弱，非清髓治疗时不需要做配型，避免了传统清髓治疗的风险 脐带血干细胞数量多（总数大于1108个），干细胞

20、再生能力较骨髓干细胞强，临床治疗效果更好 对脐血干细胞在溃疡性结肠炎治疗中的作用机制需要更深入研究，从而为阐明溃疡性结肠炎粘膜损伤无法修复的原因及从根本上治疗该病提供新的思路,干细胞治疗的途径与方法,手术当日上午在无菌条件下实施骨髓采集术。 在进行自体骨髓采集时应注意的是: 1 严格执行无菌操作, 控制入室人数, 避免交叉感染; 2 预防凝血: 先将储髓袋用肝素盐水浸润内壁行预处理, 然后将肝素盐水抽出弃掉将抽取的骨髓慢慢注入储髓袋内并且轻轻摇晃, 防止凝血。 3 预防细胞溶血, 护士应密切配合医生进行骨髓采集, 尽可能缩短骨髓抽吸时间, 将骨髓注入储髓带时应慢注、轻摇, 避免细胞溶血, 从而

21、防止干细胞提取数量的减少。 将骨髓立即送无菌实验室进行骨髓干细胞体外分离提取, 并将提取的干细胞6 h内移植到患者体内。,护 理,1 心理护理 UC 是一种病因不明的结肠炎性疾病, 既有精神因素的影响, 又有典型躯体症状,因此, 加强心理护理, 积极调整患者心态, 稳定情绪 2 移植前护理 常规术前准备: 手术前两天皮 下注射集落细胞刺激因子每天1支; 前一天腹股沟备皮, 做碘过敏试验; 消毒骨髓采集室。 3 移植前护理 常规术前准备: 手术前两天皮下注射集落细胞刺激因子每天1支; 前一天腹股沟备皮, 做碘过敏试验; 消毒骨髓采集室。,护 理,移植后护理： 股动脉穿刺点的护理 患者回病房后要取

22、平卧位, 术肢伸直, 勿屈曲、制动6 12 h, 防止穿刺处出血。弹力绷带加压包扎, 沙袋压迫穿刺部位6 h; 注意观察下肢皮温及足背动脉搏动, 每小时测1次, 并观察穿刺点有无出血、血肿等情况。对凝血机制差患者, 尤应注意术肢制动, 避免患者屈肢、活动导致穿刺点出血。 生命体征监测 术后6 12 h内进行持续心电监测, 测体温4 /d。生命体征如有变化应及时报告医生, 查找原因, 给予相应处理; 观察腹泻次数、便颜色及形状, 了解患者营养状况有无改善。 皮肤护理 患者因低蛋白血症, 组织水肿,受压处易破溃; 又由于术后需卧床并制动穿刺侧的肢体, 不能随意变换体位。因此预防术后褥疮,加强皮肤护

23、理非常重要。护士每30 60 m in观察一次, 并协助翻身。嘱患者用手紧压穿刺点, 以另一侧肢体为轴, 保持穿刺侧肢体伸直行侧卧位, 背后及腿部各垫一软枕, 患者舒适。 营养支持,溃疡性结溃疡性结肠炎病例举例 1,男, 35岁, 2007- 07- 02 因重度溃疡性结肠炎入院。 患者间断脓血便1年余, 近10 天加重,现脓血便每日5 6次, 有黏液和里急后重。 查体: 生命体征平稳, 贫血貌, 腹痛, 脐周痛为重, 体重55 kg。 肠镜检查: 散在大量形态各异、大小不等的炎性息肉, 直径03 08 cm, 乙状结肠、直肠黏膜弥漫性充血水肿, 见多发浅溃疡及糜烂灶.肠腔稍狭窄。 诊断为重度

24、溃疡性结肠炎。,病例举例 1,2007-10-6行自体骨髓干细胞移植术 术后给予抗炎、营养补液治疗, 病情有好转。 2008- 03- 1复查肠镜可见: 直肠溃疡愈合后瘢痕及多发炎性息肉, 未见活动性溃疡及糜烂, 为溃疡性结肠炎(缓解期)。,2007-10-6细胞治疗后 2008- 03- 1复查肠镜,2007- 07- 02 结肠镜,病例举例 1,男, 20岁, 2008- 03- 06 因重度溃疡性结肠炎入院。 1月前无明确诱因出现腹泻、腹痛, 排黏液脓血便每日10 20次, 无里急后重, 伴恶心、呕吐, 发热, 体温38.5 , 明显消瘦(体重下降至42 kg), 生活不能自理。 查体: 生命体征平稳, 贫血貌, 中下腹压痛阳性, 肠鸣音活跃。 便常规: 白细胞40 50 /HP, 红细胞13 140 /HP, 血白细胞12.6 109, 中性0.847, 血清白蛋白31.5 g /L, 血沉36mm /h。 肠镜检查: 全结肠重度溃疡性结肠炎, 伴活动性出血。 2008-3-