细胞凋亡201110研究生.ppt

1、细胞凋亡及其研究进展,邱春红 山东大学医学院，细胞生物学研究所 办公地址：教学6楼，6612室 联系方式： 电话：88382046 Email: ,细胞凋亡的概念及特征 细胞凋亡的过程及其调控机制 细胞凋亡与疾病及其实验检测方法,细胞凋亡的概念及特征,一. 细胞的死亡形式 二. 细胞凋亡的概念形成 三. 细胞凋亡的研究历程 四. 细胞凋亡的严格定义 五. 细胞凋亡的生物学特征,一.细胞死亡,细胞的生命过程包括分裂、增殖、分化而死亡 细胞死亡是指细胞生命结束的现象。,1.细胞死亡的原因 生理性： 细胞正常新陈代谢， 特征为端粒（telomeres）的缩短 病理性： 急性，强烈损伤 细菌，病毒感染

2、,2009年诺贝尔生理医学奖 端粒和端粒酶的研究成果,死亡的不同形式,2.细胞死亡的不同形式,二.细胞凋亡的概念形成 细胞凋亡是借古希腊语， 表示细胞像秋天的树叶一样凋落的死亡形式。 1965年澳大利亚科学家发现肝实质组织中 聚集一 些死亡细胞，从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎性反应。 2. 1972年Kerr正式提出细胞凋亡的概念。,伴随细胞凋亡的生理过程,三.细胞凋亡的研究历程 1. 初期概念的形成 1965-1972 2. 形态学及生物化学的研究阶段 1972-1987 1）光镜和电镜对形态学特征进行详细研究 2）细胞内部结构-染色体DNA的变化 3）钙离子浓度的变化-发生凋亡的条件

3、 4）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡需要核酸内切酶参与 分子生物学研究阶段 细胞凋亡的 相关基因调控，信号转导，凋亡分子的相互 作用及关系 临床应用基础研究阶段 凋亡机制的阐明有利于疾病的新疗法的探索及问世,凋亡的研究对象 C elegans 线虫,Life cycle of C. elegans(秀纤虫）,C elegans 线虫的特征 1. 生命周期短 受精卵发育到成虫仅3天 2. 细胞数量少 1090个细胞 3.凋亡模式简单 131个细胞消失 固定的时间和固定的位置,PRIZED Horvitz, and Sulston share Physiology or Medicine Nobe

4、l （2002） “for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death”,细胞凋亡（apoptosis) 形态学 是一个主动的，由基因决定的，自主结束生命的过程。 遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。 程序性细胞死亡（programmed cell death)- 发育学 即在一定时间内，细胞按一定的程序发生死亡， 这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。 共同特征：散在的，逐个地从正常组织中死亡和消失， 机体无炎症反应,四.细胞凋亡的定义,细胞

5、坏死是指在外来致病因子的作用下，细胞生命活动被强行 终止所致的病理性、被动性的死亡过程。 细胞膜与胞浆中的细胞器的质膜发生破裂，细胞浆 外溢，细胞解体并引起周围组织发生炎症反应。,细胞凋亡是指在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触 发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。 细胞膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成 一些囊状小体，即凋亡小体（apoptotic body), 后者被周围吞噬细胞吞噬，不引起炎症。,五.细胞凋亡的生物学特征,主要有：细胞皱缩（cell shrinkage), 染色质凝聚 （ chromatin condensation)、 凋亡小体（Apoptotic b

6、ody）形成 细胞骨架解体,1，细胞凋亡的形态变化,A、Normal cell,B、Apoptosis: Apoptotic bodies,凋亡的起始： 细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间连接消失，可发生皱缩，但细胞膜依然完整； 细胞质密度增加，线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合； 染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜下分布。染色质进一步聚集是核膜在核空处断裂，形成核碎片或核残片。 凋亡小体的形成： 核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体

7、。 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。,细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：,核酸内切酶活化-DNA 片段化（fragmentation),2，细胞凋亡的生化变化,3，细胞凋亡的重要特征,Eat me 信号-PS的表达,磷脂酰丝氨酸（PS）存在于正常细胞膜的内侧，细胞发生凋亡时，会翻转到细胞膜外侧。是吞噬细胞识别凋亡细胞的重要标志。,细胞凋亡与细胞坏死的对比,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞凋亡与细胞坏死

8、的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死

9、,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,细胞体积 固缩变小 肿胀变大,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成

10、群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,细胞体积 固缩变小 肿胀变大,凋亡小体 形成，被临近或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,细胞体积 固缩变小 肿胀变大,凋亡小体 形成，被临近或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶,基因组DNA 有控降解，DNA ladder出现 随机降解，电泳呈涂抹状,炎症反应

11、无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,线粒体 有功能 ，有些被自身吞噬？ 肿胀,细胞体积 固缩变小 肿胀变大,凋亡小体 形成，被临近或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶,基因组DNA 有控降解，DNA ladder出现 随机降解，电泳呈涂抹状,基因活动 有基因调控 无基因调控,炎症反应 无 有,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死,比较内容,起因 生理、病理 病理或剧烈损伤,范围 单个散在细胞 大片

12、组织或成群细胞,细胞膜 保持完整，到凋亡小体 破损,细胞核 固缩，DNA片段化 弥散性降解,染色质 浓缩 呈絮状,线粒体 有功能 ，有些被自身吞噬？ 肿胀,细胞体积 固缩变小 肿胀变大,凋亡小体 形成，被临近或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶,基因组DNA 有控降解，DNA ladder出现 随机降解，电泳呈涂抹状,基因活动 有基因调控 无基因调控,能量 需要ATP 不需ATP,炎症反应 无 有,Contrast of Apoptosis and necrosis,Apoptosis,Necrosis,Death by apoptosis is a net, orderly process,细胞凋亡

13、的过程及其调控机制,细胞凋亡的影响因素 细胞凋亡的诱导方式 三. 细胞凋亡的发生过程 四. 细胞凋亡的分子调控机制,一. 细胞凋亡的影响因素 生理性因素 生长，发育，衰老过程 激素及生长因子水平的变化 病理性因素 物理因素 外力，高温，紫外线，放射线 照射 化学因素 强酸，强碱，药物 炎症，病毒感染，,二. 细胞凋亡的体外诱导方式 非特异性诱导 紫外线或者放射线 特异性 诱导 死亡基因诱导,三. 细胞凋亡的发生过程,膜受体，线粒体,Caspase参与的调控作用,凋亡的执行过程,凋亡的启动过程,凋亡的清除过程,Eat me 信号参与的调控作用,一，细胞凋亡的诱导途径,1. 细胞凋亡的膜受体通路,

14、FAS是细胞表面受体，在多种细胞中表达。 尤其是在肝细胞中，表达水平高，应用广泛,CAD (Caspase-activated Dnase, an endonuclease).,2. 细胞凋亡的线粒体通路,线粒体结构及功能,线粒体位于细胞质中， 是细胞产生能量的场所。 即细胞的发电厂。,不同的细胞线粒体的数量不同。越活越的细胞含线粒体的数目越多。 时刻跳动的心脏细胞和经常思考问题的大脑细胞含有线粒体的数目最大，皮肤细胞含有线粒体的数目比较少。,细胞色素外流,线粒体途径发现的背景,发现此途径最大的贡献者 王晓东,1991-95，博士后，在美国德州大学西南医学中心，从师于 JosephL.Gold

15、stein和Michael S.Brown，Nobel Price获得者，从事胆固醇调节基因的表达调控的研究。,1993， 王和他的同事利用gel shift assay跟踪纯化，从Hela细胞核中分离并纯化出通过线粒体途径诱导细胞凋亡的蛋白。,命名为Apaf1和caspase9,线粒体在细胞凋亡中的作用,4）线粒体释放细胞色素C（cytochrome C, cytC)而cytC是凋 亡所必需的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族的激活物。,1）线粒体呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡。,2）线粒体是细胞产生活性氧类物质（reactive oxygen species, ROS)的主要

16、来源，ROS是细胞凋亡的信使分子 和效应分子，凋亡时，线粒体生成ROS增多。,3）线粒体渗透转变孔（permeability transition pore, PT pore） 通透性增高，这是凋亡早期的决定性变化。PT孔是线粒体 内膜和外膜在接触部位协同组成的一条通道，线粒体内的cyt C 可通过开放PT孔释放到胞质，进而触发caspase 级联反应。,二，细胞凋亡的执行,Caspase 家族,Active site: Cysteine Cleavage site: Asparatic acid,Cysteine Asparatic acid specific protease,Aps-Xx

17、x,天冬氨酸特异性的半光氨酸蛋白水解酶,存在于细胞质中一类半胱氨酸蛋白酶 高度选择性地切割蛋白，具有很强的特异性,1.有高度保守的QACXG五肽序列 2. 有发挥酶活性所必需的半胱氨酸 3.特异性的裂解天冬氨酸位点 4.前体蛋白无活性，均须蛋白水解后才产生活性 5.转染不同细胞可诱导凋亡 目前哺乳动物中共发现14种Caspase,按其发现的顺序先后命名为Caspase 1-Caspase-14,Caspase 共同特点,caspase-2,caspase-8,caspase-9, caspase-10 参与凋亡起始 Caspase-3,caspase-6, caspase-7 参与凋亡执行，它

18、们能降解多种底物，导致核纤层和细胞骨架的断裂崩解。,Caspase 家族活性,Ca 2+ 库开放，胞内Ca 2+ 升高，可作为凋亡启动的信号。,Ca 2+与细胞凋亡系统的成分有机会接触，发生反应，从而触 发凋亡,3. 细胞凋亡的钙离子通路,四. 细胞凋亡的分子调控机制,2.细胞凋亡相关基因的发现与 细胞凋亡信号途径的发现,1.细胞凋亡的两大途径（死亡受体与线粒体途径）,3.细胞凋亡受多种基因控制,受体介导的凋亡-Fas 和FasL,Fas 属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR)和神经生长因子受体(nerve growth factor

19、receptor, NGFR）超家族的的细胞表面分子。 Fas配体（Fas ligand, FasL)是TNF家族的细胞表面分子。多种哺乳动物细胞表达Fas，而FasL只在活化的T细胞表达。,Fas (also called Apo-1 or CD95) 肿瘤坏死因子受体的超家族成员。 与陪体结合后会迅速启动细胞凋亡。 诱导细胞凋亡操作简单而特异性强，已成为实验室诱导凋亡的常用方法之一。,Pathways to cell death in C. elegans and mammals,调控线虫细胞凋亡的关键基因,Early researches (MIT: Robert Horvriz , 1

20、986),C. elegans:1090 cells, The Finding of CED3 mutant Without losing any of their cells to apoptosis. CED3 gene play a crucial role in the process of apoptosis.,131 cells death.,甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS），DNA化学诱变剂。诱导4000条线虫，发现两个突变体，都在ced3 上发生了隐性突变。,后来又发现另一个与ced3 相近的基因ced4, 两者在同一染色体上。Ced3 、c

21、ed4的突变可导致应该凋亡的细胞不凋亡。,后续还发现ced9基因的突变可促进细胞程序性凋亡发生。,Dr Robert Horviz伟大发现,调控细胞凋亡的ced基因家族与caspase 基因家族,DNA测序的结果表明： Ced3与哺乳动物的caspase3蛋白酶同源，ced4与人类凋亡蛋白酶激活 因子1（Apaf-1）同源。Ced9 基因与人B淋巴细胞中发现的凋亡抑制因子bcl2 原癌基因同源。,Apaf-1的发现者-王晓东,什么小分子启动或激活了凋亡体系？,什么分子对caspase3原进行了酶切？,柱子内的部分，王晓东纯化,不与柱子结合的部分，学生 刘雪松纯化,王对已被激活的凋亡反应的细胞质

22、裂解液进行了分级分离。,他研究了caspase3与细胞核DNA 被剪切的分子机制，受Apaf-1基因调控。,他研究了cytC释放的机制，发现bcl2可抑制cytC线粒体的释放，从而抑制细胞凋亡。,50% 硫酸铵沉淀滤过的蛋白,王晓东的学生发现上清中的蛋白很少，但却含有活性.,是不是因为细胞破碎太剧烈，弄破了线粒体？ 用蔗糖保护的方法。结果还有cytC.,把细胞裂解液中的cytC 用抗体清除 结果细胞裂解液不引起凋亡反应。,Cyt.C的释放可以激活细胞凋亡,他还发现，活性的caspase8促进cytC从线粒体释放。 caspase8剪切tbid, tbid的C端片段从细胞质转位到线粒体，引起cy

23、tC的释放。 Bcl2 可以与tbid结合并拮抗它诱导的cytC的释放。,参与调节细胞凋亡的p53基因,既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2基因家族,bcl-2基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2, bcl2）的缩写。又称”存活基因“（survival gene). 同家族的Bad，Bax，Bak,BID 是凋亡的促进者。,抑制作用,促进作用,BH3,细胞凋亡与疾病及其实验检测方法,一，细胞凋亡与疾病 二，细胞凋亡的实验检测方法,细胞凋亡的生物学意义,发育过程 清除多余的细胞 生理活动过程 清除无用的细胞 病理活动过程 清除有潜在危险地细胞,一，

24、细胞凋亡与疾病,一，细胞凋亡与疾病,（1）细胞凋亡不足 肿瘤：凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达-凋亡衰减 促凋亡基因如p53基因突变或缺失，肿瘤发生率 一般肿瘤细胞高表达FasL,借以凋亡淋巴细胞，而又 低表达Fas，而降低自身凋亡。（肿瘤细胞特点是： 损人利己。),一，细胞凋亡与疾病,系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus, SLE): 是典型的自身免疫性疾病。 由于Fas表达缺陷，引起自身反应性T细胞的凋亡功能丧失， 导致T淋巴细胞凋亡障碍，因此， 在外周淋巴器官出现大量CD4+, CD8+的T淋巴细胞， 这些细胞具有自身反应性，从而引起SLE自身免疫

25、性疾病,（）细胞凋亡过度 自身性免疫缺陷病艾滋病： 艾滋病病毒感染后，诱导CD4T淋巴细胞过度凋亡，导致患者免疫功能缺陷,一，细胞凋亡与疾病,由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。HIV表达gp120, 其受体在CD4的 膜上，与CD4+上的受体结合后导致CD4+凋亡，免疫系统受损。另外，HIV感染的外周T细胞对FasL的诱导凋亡很敏感。,神经系统退行性病变阿尔茨海默病,AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结,心血管疾病,心力衰竭、 心肌缺血与再灌注损伤 坏死与凋亡共存 凋亡特点：a.早期凋亡为主，晚期坏死为主 b.梗死灶中央以坏死为主， 周边凋亡为主,（）细胞凋亡过度积累 自身免疫疾病关节炎 发生凋亡的细胞，会迅速被吞噬细胞清除 如果凋亡细胞不能及时被清除，则会导致细胞壁破裂，诱发凋亡细胞转化为坏死，从而引起自身免疫疾病,一 细胞凋亡与疾病,生理性诱导因子：bcl2家族基因, TNF , FasL, TGF-，神经递质、Ca2+, 糖皮质激素等。 2.损伤相关因子 热休克，病毒感染，原癌基因、抑癌基因、细胞毒性T细胞，氧化剂、自由基。缺血、缺氧等。 疾病治疗相关因子 化疗，