2012第十八章-高效液相色谱.ppt

1、1,第十八章 高效液相色谱（ HPLC）,2,在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15，加上衍生化的化合物，也不过20左右。 高沸点、难挥发、热不稳定、离子型化合物、高聚物乃至生物大分子，很难用气相色谱法分析。 在经典的液体柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的柱色谱技术称为高效液相色谱法。 特点：应用范围广，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化等。,3,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,固定相 液液色谱、液固色谱 分离机制 基本类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱 其他：化学键合相色谱、离子抑制色谱、离子

2、对色谱、亲合色谱、手性色谱、胶束色谱、电色谱等。,一、高效液相色谱法的主要类型,4,二、化学键合相色谱法,以化学键合相为固定相的色谱法 （BPC） 在HPLC中应用最广 固定相：极性键合相 -CN, -NH2, 或二羟基等键合在硅胶表面 应用：分离极性、中等极性的化合物,（一）正相键合相色谱法,5,（二）反相键合相色谱法,固定相：非极性键合相 十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等键合在硅胶表面 流动相：水与水混溶的极性调整剂 甲醇水、乙腈水,6,溶质的非极性部分在与极性溶剂分子间的排斥力的作用下，和键合相的烃基发生疏溶剂缔合； 另一方面，溶质的极性部分受到极性流动相的作用，有解缔合作用。,

3、1. 疏溶剂理论,7,2. 保留行为的主要影响因素,（1）溶质分子的结构 溶质的极性越弱，疏水性越强，则与固定相作用越强，k越大，tR也越大。 （2）流动相 流动相表面张力越高，k越大 流动相介电常数越大，k越大 水的表面张力最大，有机溶剂含量增加，k值变小 （3）固定相： 键合烷基碳链越长，疏水性越强，k越大,8,（三）反相离子对色谱法,在固定相上涂渍或流动相中加入与溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法 反相离子对色谱 固定相：C18或C8键合相 流动相：含有离子对试剂的有机溶剂水溶液 应用 适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分

4、离的离子型和非离子型混合物的分离，还可借助离子对的生成引入紫外吸收或发荧光的基团,9,1. 离子对模型,10,2. 影响容量因子的因素,（1）离子对试剂的种类和浓度 季铵盐，分析带负电荷的物质 烷基磺酸盐或硫酸盐，分析带正电荷的物质 试剂浓度：在浓度较低时，浓度升高，k增大 试剂的烷基碳链越长，k越大 （2）流动相的pH 对弱酸、弱碱的保留有很大的影响,11,三、其他高效液相色谱法,离子交换色谱用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器为通用检测器 分类 抑制型（双柱型）、非抑制型（单柱型） 应用 无机和有机阴、阳离子，氨基酸，糖类，DNA和RNA的水解产物,（一）离子色谱法,1

5、2,如样品为阳离子，用无机酸作为流动相，抑制柱为强碱性阴离子交换剂。 在抑制柱中发生两个重要反应： R+OH- + H+Cl- R+Cl- + H2O R+OH- + M+Cl- M+ OH- + R+ Cl- 式中， R+OH- 为抑制柱中的阴离子交换剂， M+为被测阳离子。 抑制柱的作用：使流动相中的酸生成H2O，使流动相电导率大大降低；还使样品阳离子从原来的盐变成相应的碱，提高了组分电导检测的灵敏度。,13,（二）手性色谱法,利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法 分离原理 对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构“配合物”，因稳定性的不同而分离,14

6、,（三）亲合色谱法,利用或模拟生物分子之间的专一性亲合作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的一种色谱方法 应用 生物大分子的分离和分析 在各种色谱法中，选择性最高,15,第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相,采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相为化学键合固定相 非极性键合相 C18 ODS、C8、C1、苯基 弱极性键合相 醚基、二羟基 极性键合相 Si(CH2)3NH2、 Si(CH2)2CN,一、化学键合相色谱法的固定相,（一）键合相的种类,16,（二）键合相的特点,1. 键合反应 多为硅氧烷型键合相，以氯硅烷与硅胶反应而得,2. 含碳量和覆盖度 含碳量：对键合硅胶进

7、行元素分析得到 表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾：残余硅醇基的钝化处理,17,二、化学键合相色谱法的流动相,18,选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（流动相在使用前需用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒，还要进行脱气）,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,19,（一）流动相对分

8、离的影响,其中n由固定相及色谱柱填充质量决定，主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。 改变流动相中各种溶剂的配比，能改变其洗脱能力，组分的k也改变。,20,斯奈德溶剂极性参数,为罗氏极性分配系数，下标e、d、n分别代表乙醇、二氧六环和硝基甲烷 P值越大，则溶剂极性越强，正相洗脱能力越强,（二）溶剂的强度和选择性,1. 溶剂的极性和强度,21,反相键合相色谱法的溶剂强度常用强度因子S表示。 S越小，溶剂极性越强，反相洗脱能力越弱。,反相色谱常用溶剂的强度因子,22,2. 混合溶剂的极性和强度,3. 溶剂的选择性,23,常用溶剂的极性参数P和选择性参数,24,25,（三）流动相最优化方法简介,

9、优化标准： 实现最难分离物质在理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离 调节溶剂极性可使样品组分的k值在适宜的范围,26,例 在一反相色谱柱上，当流动相为30甲醇和70水（体积比）时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为0.35min。如何调整溶剂配比使组分的容量因子为5？,解,调整溶剂比例为75甲醇和25水，可使k为5,27,三、分离条件的选择,1. 涡流扩散：固定相颗粒310um 2. 纵向扩散：很小，可忽略 3. 传质阻力 （1）固定相传质阻力 化学键合相色谱中，键合相多为单分子层，可忽略 （2）流动相传质阻力 与固定相颗粒粒度的平方成正比，与组分分子在流动相

10、中的扩散系数成反比,（一）高效液相色谱法中的速率理论,28,（3）静态流动相传质阻力 因固定相的多孔性导致流动相的滞留而形成的传质阻力 与固定相颗粒粒度的平方成正比，与组分分子在流动相中的扩散系数Dm成反比 流动相的粘度低，则Dm大，传质阻力小，所以常使用低粘度的甲醇、乙腈作溶剂,（4）固定相粒度对塔板高度的影响 粒度小有利于保证高效液相色谱的高柱效,29,（二）正相键合相色谱法的分离条件,分离含双键的化合物，常用氰基键合相 分离多官能团化合物，常用氨基键合相 流动相：烷烃极性调节剂,（三）反相键合相色谱法的分离条件,ODS是应用最广的非极性固定相 短链烷基键合相可用于极性化合物的分离 苯基键

11、合相适用于芳香化合物和多羟基化合物 流动相：水甲醇、水乙腈 抑制剂：醋酸、氨水、磷酸盐或醋酸盐等，调pH，抑制组分离解，增强保留，减少脱尾。,30,（四）反相离子对色谱法的分离条件,（1）离子对试剂 分析酸、带负电荷的物质时，常用季铵盐 分析碱、带正电荷的物质时，常用烷基磺酸盐或硫酸盐 （2）流动相的pH 调节pH，试样组分和离子对试剂全部离子化 （3）有机溶剂及其浓度 有机溶剂的比例越高，极性越小，k越小 被测组分或离子对的疏水性越强，即极性越弱，需有机溶剂的比例越高,31,四、其它固定相,1. 键合型离子交换剂 在硅胶表面键合上各种离子交换剂 阳离子型键合相：强酸性磺酸型 -SO3H 阴离

12、子型键合相：季铵盐型-NR3Cl 2. 手性固定相 蛋白类、多糖、环糊精、-氢键型、配体交换等 3. 亲和色谱固定相 载体配基,32,分离方式的选择,在选择色谱分离方式 前要了解样品性质： （1）样品是大分子还是小分子？分子量在什么范围？ （2）样品是水溶性的还是有机溶剂可溶的？ （3）样品是离子状态还是非离子状态？,样品,相对分子量 2000,相对分子量 2000,水溶,非水溶,水溶,非水溶,离子型,非离子型或可形成离子对,离子交换色谱或离子色谱,正相键合相色谱,溶于非极性或弱极性溶剂,（极性在CHCl3之下）,溶于中极性或极性溶剂,（极性在CHCl3之上）,反相键合相色谱,溶于CHCl3,

13、硅胶吸附色谱,正相键合相色谱,溶于醇、或乙酸乙酯,离子型,非离子型或可形成离子对,离子交换色谱,分子尺寸30nm,分子尺寸30nm400nm,反相键合相色谱,尺寸排阻色谱,分子尺寸30nm,分子尺寸30nm400nm,尺寸排阻色谱,反相键合相色谱,35,高效液相色谱仪器,36,高效液相色谱仪器,37,38,高效液相色谱仪器,39,第三节 高效液相色谱仪,输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理,40,一、输液系统,作用：输送流动相通过整个色谱系统 压力：150350105 Pa。 由于色谱柱很细，填充剂粒度小，柱阻大，必须有很高的柱前压力，才能获得高速的液流 要求：具备较高的输出

14、压力，流量精度高、稳定、范围宽 种类：恒压泵 恒流泵柱塞往复泵,（一）高压泵,41,42,（二）梯度洗脱装置,等强度洗脱：在一个分析周期中，流动相组成保持恒定 梯度洗脱在液相色谱中的作用相当于气相色谱中的程序升温 梯度洗脱：在一个分析周期中，按一定程序连续改变流动相中两种（或更多种）溶剂的组成和配比，使各组分都在适宜的条件下（k值范围110）获得分离 类型：高压梯度、低压梯度,43,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,44,二、分离和进

15、样系统,（一）进样器 1. 注射器 2. 六通进样阀,45,（二）色谱柱,1. 构造 由柱管（不锈钢）和固定相组成 常规分析柱 25mm 1030cm 窄径柱 12mm 1020cm 毛细管柱 0.20.5mm 310cm 类型：分析型、制备型,46,2. 性能评价 柱压、H、n、k、R等 柱效：主要取决于柱填料（固定相）的性能和装柱技术 3.预柱（保护柱） 连接在进样器和色谱柱之间的短柱（35cm），防止来自流动相和样品中不溶性微粒堵塞色谱柱。,47,三、检测系统,作用：把色谱洗脱液中组分的量（或浓度）转变为电信号。 要求：灵敏度高、响应快、重现性好、线性范围宽、适用范围广、死体积小、对流动

16、相流量和温度波动不敏感等 通用型检测器 示差折光检测器、蒸发光散射检测器 专属型检测器 紫外检测器、荧光检测器、安培检测器,48,（一）紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高；线形范围宽；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,49,固定波长检测器 可变波长检测器 氘灯为光源 波长可任意选择，采用样品最大吸收波长为检测波长，可增加灵敏度 光电二极管阵列检测器 多通道检测器 每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝 可获得三维光谱色谱图,紫外检测器的类型,50,1024个二极管阵列，各检

17、测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。,光电二极管阵列检测器,51,光电二极管阵列检测器,52,（二）荧光检测器,在紫外光的激发下能发荧光的化合物或能用衍生法制成荧光衍生物的物质均可进行荧光检测。 高灵敏度、高选择性，比紫外检测器的灵敏度高2个数量级。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,53,（三）示差折光检测器,利用组分和流动相的折射率之差，进行检测。 在适当的条件下对所有的溶质都有响应，应用范围宽。 对温度和流速很敏感，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。,54,示差折光检测器,55,示差折光检测器,56,（四）电化学检测器,电导检测器：

18、主要用于离子色谱法 安培检测器：测定能氧化、还原的物质，应用广泛 原理：检测池相当于一个电解池。组分通过电极表面时，当两电极间施加大于该组分的氧化（或还原）电位的恒定电压时，组分被电解而产生电流，服从法拉第定律。,工作电极,入口,出口,参比电极,辅助电极,57,（五）蒸发光散射检测器,适用于：挥发性低于流动相的组分 通用型检测器 流出物雾化室雾滴溶剂蒸发溶质气溶胶光散射光电倍增管检测散射光 散射光的对数响应值与组分的质量的对数呈线性关系,流出物,氮气,雾滴,蒸发室,气溶胶,泵,光束,58,蒸发光散射检测器 ELSD,59,ELSD的检测过程,惰性气体使色谱柱流出物雾化,在漂移管中把流动相蒸发,

19、测定留下来的样品颗粒的光散射,60,两种类型的ELSD,61,四、数据记录处理和计算机控制系统,色谱管理软件可实现全系统的自动化控制 自动采集和分析色谱数据，色谱工作站是数据采集、处理和分析的独立的计算机软件,62,第四节 高效液相色谱分析方法,1. 色谱鉴定法 2. 化学鉴定法 3. 两谱联用鉴定法,一、定性分析方法,63,二、定量分析方法,1. 外标法 外标校正曲线法 A=a+bC 2. 内标法 内标校正曲线法 Ai/As=a+bCi 内标对比法 3. 内加法 将待测组分i的对照品加入待测样品中，测定峰面积的增量，求算i组分的含量。,例 称取二甲苯试样110.0mg，加入对二甲苯对照品30.0mg，用反相色谱法测定，加入对照品前后的色谱峰面积（mm2） ：对二甲苯为40.0和104.2，间二甲苯为141.8和156.2。计算对二甲苯的百分含量。,解,例 测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱，称取内标物，黄连碱和小檗碱的对照品各0.20