过程分子生物学(1 ）

1、华东理工大学硕士研究生学位课程,过程分子生物学,张 惠 展,分子生物学是生命科学的主导性学科,基因的表达与调控是分子生物学的主题思想,过程分子生物学是分子生物学理论发展的高级阶段,1953-1983 基础分子生物学阶段,20世纪50年代 DNA双螺旋模型的建立,20世纪60年代 遗传密码的破译,20世纪70年代 DNA重组技术的诞生,1983-？ 过程分子生物学阶段,20世纪80年代 动植物转基因技术的问世,20世纪90年代 人类基因组计划的实施,21世纪00年代 RNA干扰现象的发现,过程分子生物学,5,2,3,4,1,6,基因表达的调控机制,细胞通讯的分子机制,免疫多样性的分子识别,胚胎发

2、育的基因表达谱,肿瘤发生的分子机制,基因组学与系统生物学,基因表达的调控机制,B,C,D,A,E,F,原核生物基因表达的启动开关,真核生物多转录因子的协同作用,原核生物的RNA结构调控,真核生物的RNA剪切调控,原核生物反义RNA的调控,真核生物sRNA介导的RNA干扰,G,真核生物应答元件的转录调控,1A 原核生物基因表达的启动开关,通过对100多个大肠杆菌启动子的序列分析，结果表明：大多数具有普通生理生化功能的基因所属的启动子，具有统一的特征序列。,a 大肠杆菌启动子的多样性,TTGACA,AACTGT,TATAAT,ATATTA,16 - 10 bp,5 - 9 bp,结构基因,转录起始

3、位点,-35区 T82T84G78A65C54A45,-10区 T80A95T45A60A50T96,启动子,一个典型的大肠杆菌启动子通常包括下列四个结构要素：,1A 原核生物基因表达的启动开关,绝大多数原核生物的RNA聚合酶均由五个亚基组成：a2bbs（全酶），其中a2bb称为（核心酶）。各种原核细菌的a、b、b亚基呈高度的同源性，唯独s因子差别较大。RNA聚合酶核心酶对DNA链具有非特异性的亲和力（碱性蛋白与酸性DNA之间的静电引力），但s因子增强了RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合。s因子帮助RNA,a 大肠杆菌启动子的多样性,聚合酶识别启动子，同时启动转录。,大肠杆菌启动子与s因子的

4、对应关系 （Lewins GENES X 2010）,氨基酸,-35区序列,识别数,间隔区,-10区序列,因子/基因,TTGACA,TATAAT,1000,16-18 bp,613,s 70（rpoD）,CTGGNA,TTGCA,5,6 bp,477,s 54（rpoN）,CCCTTGAA,CCCGATNT,30,13-15 bp,284,s 32（rpoH）,TTGACA,TATAAT,100,16-18 bp,330,s S（rpoS）,CTAAA,GCCGATAA,40,15 bp,239,s F（rpoF）,GAA,YCTGA,20,16 bp,202,s E（rpoE）,2,173,

5、s FecI（fecI）,TGNCTG,CGTCTT,15 bp,1A 原核生物基因表达的启动开关,枯草杆菌中存在着大约二十类不同的启动子，其中有些隶属于正常的生理代谢基因，有些则隶属于噬菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中的相关基因。,b 枯草杆菌启动子的多样性,在SPO1噬菌体感染过程中的RNA聚合酶及其s因子,SPO1噬菌体感染枯草杆菌后，早期基因表达；4-5分钟后，中期基因表达，早期基因关闭；8-12分钟后，晚期基因表达，中期基因关闭。早期基因的启动子由s43（即sA）识别启动，这是枯草杆菌细胞内具有广泛生理生化功能的s因子，与大肠杆菌中的s70同源，组成a2bbs43型RNA聚合酶，转

6、录中期基因表达所需的s因子编码基因gp28。中期基因的启动子由sgp28识别启动，它与枯草杆菌的核心酶构成a2bbsgp28型RNA聚合酶全酶，负责转录晚期基因表达所需的s因子编码基因gp33和gp34。晚期基因的启动子由sgp33和sgp34识别启动，,分别构成RNA聚合酶全酶a2bbsgp33和a2bbsgp34。,SPO1噬菌体基因表 达的级联调控模式,通过更换不同的s因子，,识别并作用于不同基因,的启动子，最终导致这,些基因有次序地级联表,达。前一基因编码后一,基因表达所需的s因子。,s43,s28,s28,s33 / 34,早期基因,中期基因,晚期基因,（Lewins GENES X

7、 2010）,枯草杆菌的孢子生成过程,枯草杆菌在对数生长阶段结束后，培养基中营养物质耗尽，这时便启动孢子生成过程：先是DNA复制，隔膜形成，孢衣合成，母体裂解，孢子释放。最后在细胞内约40%的mRNA是孢子生,专一性的。,对数生长期细菌,基因组复制,隔膜形成,DNA转位至前孢,孢衣形成,母细胞裂解，孢子释放,（Lewins GENES X 2010）,枯草杆菌孢子形成过程中的RNA聚合酶及其s因子,当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连串的磷酸基团传递反应，最终导致转录调控因子Spo0A的磷酸化。磷酸化了的Spo0A同时启动两种不同操纵子的转录，分别表达出sproE和sF。s

8、F一方面启动sG的表达，另一方面又表达SpoIIR，后者再激活隔膜结合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA将母体细胞中表达的sproE裂解为有活性的sE；而在前孢区域内产生的sE均被前孢特有的蛋白酶摧毁殆尽。母体细胞中sE的活性是激活前孢区域sG所必需的（通过SpoIIA和一种未知蛋白因子）；而sG的活性又能产生一种信号，跨隔,膜激活母体细胞中的sK。即：sF sE sG sK 。,枯草杆菌孢子,子交叉激活,形成过程中两,条途径的 s因,sF,sE,sG,sK,激活,表达,前孢区,母细胞,Spo0A,Spo0A,s43,s43,sF,sproE,sE,sG,sproK,隔膜,SpoII

9、R,SpoIIGA,SpoIIA,sK,5 h,5 h,打开262个基因,打开75个基因,打开48个基因,打开81 个基因,SpoIVB,枯草杆菌各类s因子识别启动子的序列偏好性 Science 335 2012,1A 原核生物基因表达的启动开关,链霉菌启动子的结构具有很大的离散性，通过对100多个启动子序列的比较，可将链霉菌启动子分成三大类：,c 链霉菌启动子的多样性,具有典型原核生物启动子-10区和-35区特征的启动子，仅占21%,具有典型原核生物启动子-10区而无保守的-35区的启动子,既无典型原核生物启动子-10区又无保守的-35区的启动子,1A 原核生物基因表达的启动开关,天蓝色链霉

10、菌（Streptomyces coelicolor）的全基因组中存在多达65种不同的s因,c 链霉菌启动子的多样性,s66（hrdB）,链霉菌最重要的s因子，hrdB-突变是致死性的。hrdB基因全程,表达，称为看家基因。,sWhiG（whiG）,链霉菌次级代谢基因转录所需的s因子。,sF,链霉菌孢子生成基因转录所需的s因子。,sBldN（bldN）,链霉菌气生菌丝发育基因转录所需的s因子。,sR（sigR）,链霉菌响应氧化压力基因转录所需的s因子。,sE（sigE）,链霉菌感应细胞膜完整性功能所需的s因子。,子，其中已被鉴定的有：,1B 真核生物多转录因子的协同作用,真核生物尤其是高等真核生

11、物（哺乳动物）由于其细胞的高度分化，决定了基因转录调控机制的复杂性。 与原核生物不同，哺乳动物细胞内共有三大类RNA聚合酶系统，它们均由多转录因子构成，识别三大类真核生物的启动子，分别承担rRNA、mRNA、tRNA的转录。所有三种RNA聚合酶均由8-14个亚基组成，500kD，但它们并不能单独启动基因的转录。,1B 真核生物多转录因子的协同作用,启动子由两部分元件构成。,a RNA聚合酶 I 启动转录的程序,RNA聚合酶 I 定位于核仁，负责转录rRNA编码基因。RNA聚合酶 I 只作用于一种类型的启动子，这类,高等真核生物 I 型启动子的结构,结构基因,I 型启动子,转录起始位点,上游启动

12、子元件（UPE）,核心启动子,GC丰富区,GC丰富区,增强启动效果,启动基因转录,CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG 人类的这两个重复序列具有85%的同原性,I 型启动子介导rRNA,基因转录的启动过程,RNA聚合酶 I 在 I 型启动子,处的定位需要两种转录因子,并经历三个阶段：,UBF1（UPE结合因子）,装配因子,SL1（四聚体核心结合因子）,定位因子,其中之一为 TBP,UBF1,SL1,起始位点,核心启动子,上游启动子元件（UPE）,Pol I,UBF1结合在启动子的UPE处,SL1结合在核心启动子处,Pol I 加入,TBP,1B 真核生物多转录因子的协同作用

13、,RNA聚合酶 II 定位于核内，负责转录mRNA的前体分子hnRNA。 RNA聚合酶 II 及其作用的 II 型启动子是 真核生物细胞中最广泛最典型最重要的转录启动元件。,b RNA聚合酶 II 启动转录的程序,高等真核生物 II 型启动子的结构,结构基因,II 型启动子,转录起始位点,启动子附加区,TATA BOX,转录的启动效率,转录因子和RNA pol II 识别位点,转录的时空特异性,启动基因转录,转录起始子 Inr,核心启动子,高等真核生物 II 型启动子的结构,结构基因,II 型启动子,转录起始位点,启动子附加区,TATA BOX,Inr,上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间

14、隔、排列顺序、拷贝,数上均有很大的可变性。,高等真核生物 II 型启动子的结构,结构基因,II 型启动子,转录起始位点,启动子附加区,TATA BOX,Inr,TATA BOX 位于 -25区，普遍存在于所有的真核生物细胞中，由,八对碱基组成，两侧为GC碱基对。少数不含TATA BOX 特征结构的,启动子成为 TATA-less 启动子。,RNA聚合酶 II 与转录因子复合物,装配因子,TF II A B E F H J,RNA聚合酶 II 本身由10-12个亚基组成 ，这些亚基具有类似,于原核细菌RNA聚合酶中a、b、b亚基的功能，但同样不能识别启,动子。对启动子的专一性识别由若干的一般转录

15、因子负责。这些一,般转录因子分为两大类：装配因子和定位因子。,定位因子,聚合酶 II,TBP TAF,a2bb,s 因子,真核生物：,原核生物：,II 型启动子介导的基因,转录启动过程,各种一般转录因子和RNA聚合酶 II 严格按照既定的顺序依次结合在DNA及其蛋白复合物上，每种一般转录因子的加入均使DNA-蛋白质复合物的空间构象发生一次改变，而这种构象变化又是下一轮的转录因,TATA,Startpoint,TFII D,TAFs,TBP,TFII A,TFII B,TFII F,Pol II,TFII J,TFII H,TFII E,子加入所必需的。,启动子校对,转录启动流产,转录加固,II

16、 型启动子介导的基因转录启动过程,TFIIH是唯一一种具有多重独立酶活性的一般转录因子，其酶活性包括ATP酶、双向解旋酶以及使RNA聚合酶II尾部CTD结构域磷酸化的磷酸激酶。RNA聚合酶II一旦被磷酸化，所有的一般转录因子便从转录起始复合物上剥落下来，转录由起始阶,TFII J,TFII H,P,P,P,P,段转换到延伸阶段。,TFII F / Pol II,RNA聚合酶 II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制,以RNA聚合酶 II 为核心的转录因子复合物在 II 型启动子处装配完毕后，转录启动。但随后的转录进程并非像人们想象的那么一帆风顺。事实上在很多果蝇和哺乳动物的基因中，刚刚启动

17、转录的RNA聚合酶 II 会在转录起始位点下游25-50个碱基处停顿下,来。一些蛋白因子促进RNA聚合酶 II 快速进入停顿位点，而NELF（负,延伸因子）和DSIF因子则起到稳定处于停顿状态的聚合酶 II 的作用。,快速进入停顿位点,慢速逃离停顿位点,RNA聚合酶 II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制,RNA聚合酶 II 从停顿位点逃离的先决条件是一些能促进其逃离的蛋白因子的出现。这些因子将正转录延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶 II 处，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF从RNA聚合酶II上解离，后者得以逃离，,新近的果蝇全基因扫描研究表明，三分之一以上的基因在转录

18、起始后能产生短小的RNA序列，表明这种启动子邻近区的RNA聚合酶II停顿是控制转录输出的普遍战略。（Science 327，2010）,转录加速；反之转录将缓慢进行。,1B 真核生物多转录因子的协同作用,RNA聚合酶 III 定位于核内，负责转录tRNA和小分子 核内RNA（snRNA）。相应的 III 型启动子有两种类型： tRNA编码基因所属的启动子称为内源型启动子； snRNA编码基因所属的启动子称为外源型启动子；,c RNA聚合酶 III 转录启动的程序,高等真核生物 III 型启动子的结构,结构基因,III 型内源型启动子,转录起始位点,BOX A,BOX C,BOX A,BOX B

19、,PSE,OCT,Pol III 结合区,III 型外源型启动子,转录起始位点,结构基因,III 型启动子介导的,tRNA/snRNA基因,转录启动过程,TFIIIB由TBP和另外两,种蛋白因子组成，其功,能相当于定位因子；,TFIIIA和TFIIIC属于装,配因子。,boxA,boxC,boxA,boxB,（1型） 转录起始位点,TFIIIA,TFIIIC,TFIIIA,TFIIIC,TFIIIC,TFIIIA,TFIIIC,TFIIIC,TFIIIB,TFIIIB,RNA Pol III,RNA Pol III,TFIIIB,TFIIIB,（2型） 转录起始位点,1B 真核生物多转录因子的

20、协同作用,由此可见，TBP是所有三种类型的RNA聚合酶转录系统所必需的。在含有TATA BOX的启动子中，TBP特异性地结合在DNA的相应区域；在TATA less 型启动子中，TBP与其它蛋白因子协同作用，结合在DNA的特定区域内。,1C 原核生物的RNA结构调控,RNA的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方式，其主要形式表现为转录的终止与抗终止作用。,a RNA转录的终止作用,原核细菌拥有两种机制终止RNA聚合酶的转录，它们分别称为顺式终止和反式终止。,介导转录顺式终止的内源性终止子,内源性终止子结构的组成为富含GC碱基的发夹结构以及下游的寡聚U链（通常是6个U）。它们由DNA上的终止

21、子序列编码，出现在转,5 A U C G C,A U,A U,U A,C G,C G,C G,G C,A U,A U,A U,C G,A G,G C,U A,U A,C U,C G,G C,G C,G,A,G,U,A,G U,RNA聚合酶,U U U U U U 3,录中的RNA结构中。,真核生物的转录终止机,制也与顺式终止相似。,A,G,U,A,U,介导转录反式终止的Rho因子依赖性终止子,基因转录的反式终止多见于噬菌体中。终止位点为CUU中的某个碱基，其上游 50-90 bp 的序列中无茎环发夹结构，但碱基组成特殊：C 41%，G 14%，A 25%，U 20%。在这种Rho（r）因子专一

22、性识别的终止子结构内，若缺失若干个C，甚至一个C，便会导致不能终止的,RNA聚合酶,Rho因子识别结合区,5 AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU 3,现象发生。,反式终止的机制,Rho因子呈六聚体，具有ATPase,活性。当RNA聚合酶转录出富含C的,Rho因子识别位点时，Rho因子便与转,录出的RNA链结合；,Rho因子沿RNA链向RNA聚合酶,方向移动，由于其移动速度快于RNA,聚合酶，因此当RNA聚合酶转录出终,止位点CUU时，Rho因子正好赶上；,Rho因子水解ATP释放能量，拆,开DNA-RNA杂合链，

23、转录遂终止。但,若在Rho因子与RNA聚合酶之间存在,着核糖体，则Rho因子不能终止转录,CUU,Rho因子,1C 原核生物的RNA结构调控,b RNA转录的抗终止作用,在某些特殊条件下，由RNA聚合酶引导的转录并不能在终止子处顺利终止，这种现象称为“转录过头”，其发生,RNA的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方式，其主要形式表现为转录的终止与抗终止作用。,机制是细胞内的转录抗终止作用。,细菌衰减子依赖性的转录抗终止作用,U,G,G,U,G,G,C,G,C,A,C,U,U,C,C,U,G,A,A,C,C,5 ,A,C,U,A,U,G,U,G,A,C,G,G,G,U,C,A,A,U,G,C

24、,G,U,A,A,A,G,C,A,A,U,C,A,G,A,U,A,C,C,C,A,G,C,C,C,G,C,C,U,C,G,G,G,C,G,G,A,U,U,A,A,U,U,U,U,U,U,U, 3,另一个则位于正常的基因编码区下游。细胞内条件的变化，可使基因的转录在两个顺式终止子结构的某一个处终止。这种结构称,某些细菌的结构基因含有两个顺式终止子，其中一个位于基因上游的编码区内，,为衰减子。,相互转换,细菌衰减子的转录抗终止机制,大肠杆菌的色氨酸操纵子中含有,一个衰减子结构。在基因的5端,编码区有两个连续排列的色氨酸,密码子。当细胞内色氨酸匮乏时,核糖体在色氨酸密码子处暂停翻,译，衰减子的2链和

25、3链形成双链,结构，第一个终止子结构不能形,成，转录继续进行；当细胞内色,氨酸充足时，翻译不在色氨酸密,码子处停止，结果产生终止子结,构，转录遂终止。,噬菌体抗终止因子依赖性的转录抗终止作用,大肠杆菌 l 噬菌体早早期基因和早期基因的表达产物往往是晚期,基因表达的调控因子。早早期基因表达产物的调控机制有两种：,一是作为 s 因子识别早期基因和晚期基因启动子，启动表达这两,组基因；二是作为转录抗终止因子，使宿主细胞的RNA聚合酶转,录过头，导致早期基因和晚期基因的表达。这两种方式均为正调,控作用。,噬菌体抗终止因子的作用,大肠杆菌l噬菌体感染大,肠杆菌后，在PL启动子的介,导下表达出抗终止因子N

26、蛋,白，它以一种独特的方式使,阻止Rho因子的转录终止作,用，使早早期基因转录过头,并转录出早期基因的mRNA,N蛋白的半衰期只有五,分钟，它决定了早期基因表,达周期的长短。,tL1,tR1,PL,PR,N,cro,左向转录单位,右向转录单位,抗终止因子 N,tL1,tR1,抗终止因子的工作原理,大肠杆菌 l 噬菌体的抗,终止因子N特异性识别早早,期基因内部的nut位点，并且,在RNA聚合酶到达这里时与,之结合，形成复合物。这种,复合物能有效抑制Rho因子,的结合作用，从而干扰Rho,因子介导的转录终止效应，,导致早早期基因的转录过头,Q因子以类似的机制使,得早期基因转录过头。,启动子,终止子

27、,RNA聚合酶,nut 位点,r 因子,NusB / NusE,NusA NusG,N,CGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCA,GCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT,1D 真核生物的RNA剪切调控,真核生物大多数的分裂基因（即含有内含子的基因）在转录后必须切除内含子序列。正常剪切时，外显子的序列和个数是恒定不变的；但有些基因的转录产物会出现剪切多样性（另类剪切模式），即一种基因转录物产生多种不同的mRNA，其中包括外显子的缺失或内含子的保留。甚至在某些细胞内，这些由于剪切多样性而产生的不同蛋白质会同时出现，并且均为细胞正常生物功

28、能所必需。据统计，哺乳动,物体内表达的基因90%以上是被另类剪切的。,1D 真核生物的RNA剪切调控,a RNA前体的正常剪切与另类剪切,内含子保留,5另类剪切,3另类剪切,外显子跳越,外显子相互排除,外显子组合选择,启动子另类剪切,多聚尾另类剪切,pA,pA,1D 真核生物的RNA剪切调控,b RNA前体的另类剪切导致蛋白质功能的多样化,CaMKIId 基因,E13,E14,E15,E16,E17,dA 蛋白,dB 蛋白,dC 蛋白,1D 真核生物的RNA剪切调控,c 黑腹果蝇性别决定与剪切多样性的关系,黑腹果蝇的性别决定过程由三个性别特异性的RNA剪切程序支配，涉及到三个与性别决定有关的基

29、因：,Sxl tra dsx,果蝇胚胎性别决定的最初机制 （PRINCIPLES OF GENETICS，2010）,Sxl-RNA,XX型胚胎,XY型胚胎,Sex-lethal gene Sxl X-linked,拮抗作用,Sxl 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生SXL蛋白,XX型胚胎,XY型胚胎,Sxl gene,PM,PE,E2,E3,E4 - E8,PM,PE,E2,E3,E4 - E8,含终止密码子,含终止密码子,Pre-mRNA,Sxl-mRNA,SXL protein,Pre-mRNA,Sxl-mRNA,SXL protein,No function,由最初机制控制另类剪切

30、,随后由自身控制另类剪切,tra 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生Tra蛋白,tra 基因,雄性细胞 正常剪切,雌性细胞 另类剪切,TRA 200 aa,SXL蛋白在XX型胚胎（即未来的雌性个体）中的特异性产生，巩固了果蝇胚胎发育性别决定的基础。最新的体外实验结果（2011）也证实：SXL过量表达导致原始生殖细胞分化为卵细胞；而SXL表达抑制则使原始生殖细胞分化为精细胞。Sxl蛋白含有高比例的Arg和Ser残基，类似于其它的RNA结合蛋白，是tra基因转录产物另类剪切的调控因子：,No function,SXL,终止密码子,dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生Dsx两性蛋白,与t

31、ra不同，另一个tra基因（tra2）的转录物只有一种剪切模式，因而在XX和XY两种类型的胚胎中，TRA2蛋白均存在。TRA和TRA2蛋白均含有剪切所必需的Arg-Ser型RNA结合结构域，它们共同调控位于常色体,上的两性基因dsx（doublesex）转录物的剪切模式：,dsx 基因,雌性特异性蛋白,雄性特异性蛋白,E1,E5,E4,E2,E3,E6,TRA2,TRA + TRA2,终止密码子,dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生Dsx两性蛋白,Sxl,tra,tra2,dsx,Sxl RNA,tra RNA,tra2 RNA,dsx RNA,Sxl mRNA,tra mRNA,tr

32、a2 mRNA,dsx mRNA,转录,剪切,翻译,XX,XY,雌性 蛋白,雄性 蛋白,雌性蛋白阻遏雄性发育基因表达；雄性蛋白阻遏雌性发育基因表达,1E 原核生物反义RNA的调控,反义RNA是指能与mRNA、DNA片段、RNA引物互补的RNA分子。通过与RNA引物、基因DNA片段、mRNA链的互补配对，分别抑制基因的复制、转录、翻译过程。原核生物的反义RNA由反义基因编码，其本身的转录可为蛋白因子启动转录而正调控；,亦可由蛋白因子降解反义RNA而负调控。,反义RNA在原核生物中广泛存在，是一种较为普遍的基因表达调控方式。目前，根据反义RNA原理设计的各类反义核酸，在实验生物学领域已被广泛用于基

33、因表达的特异性阻遏剂；在医学,药学领域也被用来治疗恶性肿瘤及病毒感染等疾病，即反义技术。,1E 原核生物反义RNA的调控,a 反义RNA抑制DNA复制,直接抑制机理：反义RNA直接与DNA的复制起始位点结合，阻,间接抑制机理：反义RNA与RNA引物结合，使之不能与DNA复制模板互补，从而间接影响DNA的复制。如大肠杆菌ColE1质粒的复,碍复制起始蛋白的识别与结合，导致DNA复制不能启动。,制、金黄色葡萄球pT181质粒的复制均采用这种机制。,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,

34、反义RNA间接抑制ColEI质粒的复制启动,引物型RNA,调控型RNA,1E 原核生物反义RNA的调控,b 反义RNA抑制基因转录,P 1,P 2,反义RNA能以两种不同的方式改变编码在相反链上的基因的转录；即转录干扰和转录衰减转录干扰发生在从一个启动子,反义RNA介导的转录干扰效应,处起始的转录阻遏第二个启动子启动转录。例如，丙酮丁醇梭菌从S-box反义RNA的启动子处转录出的反义RNA能阻断相反DNA链上编码的,操纵子ubiG-mccBA的转录启动。,转录干扰,1E 原核生物反义RNA的调控,b 反义RNA抑制基因转录,P 1,P 2,反义RNA也可与靶mRNA的5-端序列互补从而阻止靶m

35、RNA的继续转录，使之产生非成熟性的转录物（即转录衰减效,反义RNA介导的转录衰减效应,应）。例如：大肠杆菌中的tic-RNA（转录抑制互补性RNA）可与cAMP受体蛋白的5端mRNA区域互补结合，形成特殊的空间结构迫使其转录,停止。,转录衰减,1E 原核生物反义RNA的调控,c 反义RNA抑制mRNA翻译,反义RNA主要的调控功能表现在翻译水平上。原核生物的研究已经确定，反义RNA抑制翻译有下列三种作用方式：,与mRNA的5端非编码区（5-UTR）结合，阻碍其在核糖体上的准确定位；,与mRNA的5端编码区（主要是起始密码子AUG）结合，抑制翻译的起始；,与mRNA全编码区结合，抑制其翻译模板

36、的功能。,大肠杆菌利用反义基,大肠杆菌的ompC和ompF基因编码外膜蛋白，OmpC使胞内渗透压提高；OmpF使胞内渗透压降低。当环境渗透压增加时，膜蛋白EnvE激活胞内的OmpR蛋白，后者诱导ompC和micF两个基因转录。micF转录物是ompF-mRNA的反义RNA，它能灭活ompF-mRNA，从而降低胞内OmpF的浓度。,因调节细胞的渗透压,UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACU,GACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAA AUGAGGUAAUAAAUAAUGA,U,U,GACAGAACUUA,A

37、,C,A,C,A,A,A,U,U,A,A,G,C,G,C,C,G,U,G,U,A,A,U,C,G,G,C,G,C,U,U,U,U,C,A,GAGG：SD序列,A,AUG：起始密码子,EnvE,OmpR,micF,ompF,ompF mRNA,micF RNA,大肠杆菌利用反义基,大肠杆菌的R1质粒上含有hok和sok基因。hok编码由52个氨基酸组成的稳定的毒素蛋白，能使细胞膜去极化而杀死细胞。Sok编码hok的反义RNA。当细胞分裂时，如果子细胞没有分配到R1质粒，HoK蛋白就会杀死子细,因维持质粒的稳定性,细胞，因为亲本细胞中Sok转录出来的反义RNA不稳定而被降解；如果子细胞分配到R1质

38、粒，则Sok基因就能源源不断地为子细胞提供反义RNA，以阻断半衰期较长的hok mRNA翻译出HoK毒素蛋白，细胞得以存活。该hok/sok系统保证了细菌品系的稳定性,1E 原核生物反义RNA的调控,d 反义技术在实验生物学和医学中的应用策略,受反义RNA特异性阻断基因表达的原理启发，人们利用生物合成甚至化学合成的方法，制备了一系列针对特定病变基因（如癌基因）或病原体基因的反义试剂或反义药物，一方面期望通过这些特异性的基因表达阻断试剂，体内探查特定基因的功能（即所谓的loss-of-function战略）；另一方面也希望能利用这些反义药物对付日趋严重的基因分子疾病和病毒感染疾病。,由靶基因的反

39、向表达体内生成相应的反义RNA,将靶基因的编码序列反向接在转录起始位点的下游，转录出来的RNA即为靶基因,5,3,5,3,5,3,5,3,启动子,终止子,target GENE,target GENE,mRNA,antisense RNA,会降解RNA。,这种战略缺点在于：反义RNA分子量大，容易引起体内免疫攻击另外，核酸酶也,的反义RNA。,人工设计合成修饰型的小分子反义RNA,锁核酸 LNA,肽核酸 PNA,核糖核酸 RNA,人工设计合成修饰型的小分子反义RNA,RNA,SNA,反义吗啉寡聚核苷酸 anti-MO oligo,RNA靶分子,人工设计合成修饰型的小分子反义RNA,1F 真核生

40、物sRNA介导的RNA干扰,RNA分子在遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中扮演着重要的角色，但几十年来有关RNA的消息只能听到微弱的声音。近十几年来接连不断的发现表明，一类被称为小RNA（small RNAs）的物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因的表达水平甚至关闭基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定的组织。因此该领域的研究成果被Science杂志连续两年（2001-2002）评为年度十大科,成就之一。,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,a RNA干扰作用的发现,1993年，康奈尔大学的Su Guo在用人工合成的反义RNA阻断线虫基因表达的实验中偶然发现，反义RNA和正义RNA都能阻断

41、靶基因的表达，他对这个结果百思不得其解。直到1998年，美国卡内基研究所的Andrew Fire用确凿的实验结果证明，在正义RNA阻断基因表达的实验中，真正起作用的是小分子的双链RNA，它们是体外转录正义RNA时生成的。上述双链RNA对基因表达的阻断作用称为RNA干扰（RNAi）。随后大量的研究发现，RNAi 现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物、哺乳动物乃至人体内，它们借助于RNAi 抵御病毒的感染，,阻断转座子的转座作用，以维持其基因组的相对稳定性。,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,a RNA干扰作用的发现,RNA干扰与先前所说的转录后基因沉默、转基因沉默等术语都是一回事，

42、但常与基因表达的反义抑制相混淆。反义抑制过程并不涉及mRNA的催化降解，只是单链反义RNA物理上与mRNA结合并阻断其翻译。Andrew Fire 和 Craig Mello因他们关于线虫RNA干扰的研究（1998）而分享2006年的诺,贝尔生理学或医学奖。,b RNA干扰的作用机理,外源性的双链RNA，不管来自病毒RNA基因组的感染还是人工的导入，均在细胞质中被Dicer酶裁剪成22-24bp的短小双链片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3端含有两个凸出的碱基，负责siRNA的迁移和对靶序列的识别。在RISC复合物的协助下，双链siRNA拆成单链，然后再与具

43、有互补序列的靶mRNA分子结合，形成局部双链。后者或遭RNase的降,解，或直接阻断靶mRNA的翻译。,AGO 复合物,AGO 复合物,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,c 细胞内固有的miRNA,前已述及，siRNA是由体外来源的双链RNA经细胞内的Dicer酶加工,的sRNA被命名为：microRNA（miRNA）。,进一步的探索发现：在动物、植物、真菌的细胞核内，从结构致密的异染色质中心粒区域的DNA重复序列上会转录出一些特殊的RNA前体大分子，它们同样在类似蛋白因子的作用下，形成长度为21-23个碱基的单链sRNA分子，并发挥特殊的生物学功能。这种细胞内编码的固有,而成的。那么细

44、胞内是否也存在着固有的RNA类似物呢？,miRNA的形成,首先从异染色质中心粒区域的DNA重复序列上转录出大分子的非编码型RNA前体（pri-miRNA），后者在核内被微加工器复合物（由RNaseIII组成）先切成大约70个核苷酸的茎环结构（pre-miRNA），然后再被运输到细胞质中由Dicer进一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由几种因子装配而成。,Science 319, 1787, 2008,miRNA的生物功能,异染色质装配,外成性修饰,转录调控,转录物剪切调控,转录物稳定调控,翻译抑制,结构域构成,（Lewins GENES X 2010）,miRNA介导的翻译抑制模式,A

45、AAAA,AAAAA,AAAAA,AGO,RISC：AGO + GW182,核糖体,抑制翻译延伸,AAAAA,AA,AGO,AA,降解翻译产物,竞争帽子结构,Cap,抑制核糖体装配,抑制mRNA环化,AGO,GW182,mRNA,触发剪尾脱帽,DCP2,miRNA,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,d RNA干扰原理的应用,如果将外源的双链RNA导入细胞中，则双链RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA为模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身扩增，其扩增产物再被Dicer裂解成siRNA。后者解链并与RISC复合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另

46、一方面又以siRNA作为引物，mRNA为模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互补链，结果mRNA也变成了双链RNA。它在Dicer的作用下也同样被裂解成siRNA。通过这种体内的RNA聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。相关研究结果表明，从21-23个碱基的siRNA到几百碱基对的双链RNA都能诱发RNA干扰作用，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显优于短的双,链RNA。需要指出的是，人类和果蝇体内不存在RdRP，故无法进行上述siRNA扩增。,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,d RNA干预原理的应用,上述RNA干扰原理在分子生物学研究领域中的用途包括：,通过基因表达的特异性阻断作用，确定基因的功能,通过基因表达的特异性阻断作用，实施基因治疗,然而，如何将特定的双链RNA分子高效导入活细胞、活组织、活生物个体中，并维持其稳定性，目前还是一个技术难题。,1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰,e 生物体内的RNA世界,RNA,蛋白质编码型RNA,非蛋白质编码型RNA,rRNA,tRNA,anti