微生物的培养与利用综合复习.ppt

1、微生物的培养与利用,高考专题复习,北京高考考试说明中的要求,微生物种类及其代谢,微生物的范畴： 结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，如酵母菌、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。,微生物种类及其代谢,这些微生物的同化作用和异化作用类型分别是什么？ 同化作用： 生物体从外界获取营养物质，转化为自身组成物质的过程。 异化作用： 生物体自身物质分解，放出能量，排出废物的过程。,微生物种类及其代谢,同化作用类型： 自养型：直接利用环境中的无机物合成自身所需要的有机物。如进行光合作用的绿色植物、蓝细菌。 硝化细菌化能合成作用：利用化学反应释放的化学能，将无机物合成自身的有机物。

2、异养型：直接利用环境中的有机物合成自身所需要的有机物。如各种动物、大多数细菌等。,微生物种类及其代谢,异化作用类型： 有氧呼吸型（需氧型） C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量 无氧呼吸型（厌氧型） C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量 C6H12O6 2C3H6O3+能量,微生物种类及其代谢,微生物包括哪些类型？ 构成微生物的细胞类型有哪些？ 不同微生物代谢类型有哪些？ 同化作用+异化作用=代谢类型,微生物种类及其代谢,单细胞、 原核细胞,自养需氧型,异养需氧型,异养厌氧型,蓝细菌、 硝化细菌,醋酸杆菌、 大肠杆菌,乳酸菌、 大肠杆菌,微生物种类及其代谢,单细

3、胞、 真核细胞,多细胞、 真核细胞,异养、 兼性厌氧,异养 需氧型,酵母菌,霉菌（青霉、曲霉）,微生物种类及其代谢,微生物的代谢类型是配制培养基及培养的基础,微生物的培养,培养基 按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 基本营养成分水、碳源（有机碳、无机碳）、氮源（有机氮、无机氮）、无机盐（调节渗透压） 配制要求调整pH，添加特殊营养物质（维生素）等,微生物的培养,碳源 有机碳源：牛肉膏、酵母提取物 无机碳源： 氮源 有机氮源：蛋白胨、尿素等 无机氮源：NH3 、N2等,微生物的培养,培养基分类 按照物理性质分类： 固体培养基常用的凝固剂为琼脂 液体培养基 按照用途分类

4、： 普通培养基： 选择培养基：加入或缺少某种物质 鉴别培养基：加入特殊物质，鉴定某种微生物存在与否,微生物的培养,基本操作技术无菌条件 灭菌与消毒，避免杂菌的污染 消毒的方法： 高温（煮沸），酒精、氯气等化学药剂，紫外线照射 灭菌的方法： 灼烧、干热、高压蒸汽灭菌,微生物的培养,倒平板（无菌条件下进行） 固体培养基灭菌、融化、倒入培养皿、冷却凝固待用 接种后，盖盖、倒置、培养（防止冷凝水影响单个菌落的形成）,微生物的培养,接种的方法（无菌条件下进行） 平板划线法（培养分离出单个菌落，操作相对比较简便） 平板涂布法（按梯度稀释培养液、培养分离出单个菌落，操作有些复杂）,微生物的培养,微生物计数方

5、法 活菌计数样品稀释度足够高时，培养基表面只生长1个菌落（来源于样品稀释液中的1个活菌）。根据平板上菌落数，推测样品中大约含有多少活菌。结果一般用菌落数而不是活菌数表示。 显微观察计数红细胞计数板，观察数量，再根据浓度比例计算出菌体数量。,微生物的培养,血球（血细胞）计数板 计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为： 1 mm 、1 mm和 0.1mm 计数室的容积：0.1mm3 （万分之一毫升） 取样：稀释一定倍数的菌液,微生物的培养,血细胞计数板的取样与计数方法,（一）20格 20格 酵母细胞数/ml80小格内酵母细胞个数/80400104稀释倍数,计数顺序： 左上右上右下左下 压在格线的，

6、只统计左线和上线,微生物的培养,（二）16格25格 酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100400104稀释倍数,大肠杆菌的培养和分离,分别分装配制好的LB液体、固体培养基,实验流程,灭菌（培养基、实验所用器具等，培养皿、试管用牛皮纸或报纸包好，放入灭菌锅）,如使用高压锅，需在有压力后灭菌15min。,大肠杆菌的培养和分离,1000g/cm2压力下，121灭菌15min。,大肠杆菌的培养和分离,消毒：待高压锅或灭菌锅中的压力与大气压相同时打开锅盖，将已灭菌的物品放至超净工作台上，并打开紫外灯和过滤风的开关。,注意：打开紫外灯后，人必须离开，以免身体受到伤害。,大肠杆菌的培养和分离,将

7、大肠杆菌接种在LB液体培养基中,然后将三角瓶放在恒温摇床培养箱中振荡培养12h，温度控制在37左右。,进行扩大培养，增加大肠杆菌的数量。,为什么要振荡培养？,大肠杆菌的培养和分离,倒平板： 待三角瓶中的LB固体培养基冷到60时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子从广口瓶中夹出酒精棉球擦试桌面和手。 注意： 一定要在擦试手之前点燃酒精灯，以免发生危险。 不要把培养基沾在培养皿壁上，以免污染。,划线分离： 将摇床上培养12h的三角瓶打开，接种环部分深入到菌液中。然后，在装有固体培养基的每个培养皿平板上连续划线 。划线后盖好培养皿。,消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。,实

8、验1 大肠杆菌的培养和分离,培养： 将培养皿均需倒置摆放到37恒温培养箱中培养1224h，,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并凝结成水滴留在培养皿的盖上；水蒸气形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。,实验1 大肠杆菌的培养和分离,实验结果： 培养皿的LB固 体培养基中可看到在 划线的末端位置出现不 连续的单个菌落 ，表明 大肠杆菌已被分离。 菌种保存： 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再划线接种在空白斜面上，37培养24h后，4冰箱保存。,大肠杆菌的培养和分离,大肠杆菌的培养和

9、分离,为什么要先将大肠杆菌培养在LB液体培养基中？ 液体培养基 扩大培养，使培养物浓度增加，以便分离 然后将大肠杆菌接种到固体平板培养基上培养，目的是什么？ 固体培养基分离获得单个菌落，消除杂菌污染，筛选高表达量的菌株的简便方法。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,实验目的 1使用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌） 2使用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应 3说明测定细菌数量的原理与方法,分离以尿素为氮源的微生物并计数,实验原理 （1）琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生

10、物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是： 其主要成分不能被微生物利用； 可使培养基固化； 不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,实验原理 本实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,（2）酸碱指示剂（鉴定） 尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解产生了NH3，溶液会呈碱性。 本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.48.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情

11、况下呈红色，,实验原理 以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,分离以尿素为氮源的微生物并计数,关键技术“涂布分离法” 涂布分离时，需要先将菌液稀释，一般稀释到10-510-7之间，然后取0.1mL的不同稀释度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再用消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在适当的稀释度下，可培养产生相互分开单个的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。

12、将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，再做功能性实验。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,基本操作步骤 （1）制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至60 左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至2个培养皿中（做两组，共4个空白平板），轻轻摇匀，平放至凝固。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,（2）制备细菌悬液：在无菌条件下，在将1g土样加到装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液，并依次制备出10-310-7稀释液。例如，若想制备10-6的稀释液，可取0.5 mL 10-5的稀释液。取样时，尽量只取

13、悬液 ，倒入有4.5 mL无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,（3）涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取 0.1 mL的稀释度为10-4和10-5的土壤稀释液（细菌悬液） ，分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。,分离以尿素为氮源的微生物并计数,（4）将培养皿倒置摆放在37恒温箱中培养2448h，观察菌落数 。 观察实验结果 计数：统计培养基上菌落数,分离以尿素为氮源的微生物并计

14、数,培养基上菌落数统计比较 与稀释度为10-5相比，LB培养基中的菌落数在10-4处理中多，尿素培养基中的菌落数在10-4处理中少。 在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中的菌落数少于LB培养基中的菌落数，其原因是 。,微生物培养的利用,培养基的选择作用 在培养基配制过程中，加入或减少某种特殊成分，筛选培养出只能在此培养基上成活的微生物。如：转基因工程菌的筛选，重组质粒上有抗生素的抗性基因，加入抗生素，无抗性基因的菌体死亡，转基因工程菌成活。有特殊作用菌群的筛选。,微生物培养的利用,自然界中菌种的分离 配制选择培养基，接种分离培养 利用微生物进行发酵来生产特定的产物 1、酿酒 微生物的选择：异养

15、厌氧型（酒精发酵型） 原理：利用无氧呼吸，获取代谢产物 2、制醋 微生物的选择： 醋酸杆菌（异养需氧型） 原理：醋酸杆菌在有氧条件下将酒精氧化成醋酸,微生物培养的利用,利用微生物进行发酵来生产特定的产物： 3、做腐乳 微生物的选择：霉菌（毛霉、根霉） （异养需氧型） 原理：毛霉或根霉中的淀粉酶和蛋白酶将豆腐中的淀粉、蛋白质水解为糖、多肽和氨基酸。 4、做泡菜 微生物的选择：乳酸菌（异养厌氧型） 原理：密闭条件下，乳酸菌的发酵作用，发酵产物乳酸不断积累，抑制其他菌的活动。,泡菜发酵的过程分析 发酵初期： 刚入坛，其表面带入的微生物，如大肠杆菌、酵母菌等比较活跃，进行酒精发酵和异型乳酸发酵，产生较

16、多的CO2，酸性小；还有一部分硝酸盐还原菌活动，亚硝酸盐含量增加。坛内逐渐形成厌氧环境，乳酸菌开始逐渐活动。菜质咸而不酸，有生味。,泡菜发酵的过程分析 发酵中期： 乳酸菌大量繁殖活动加强，进行同型发酵，乳酸产量增加，pH为3.53.8。大肠杆菌、酵母菌等不抗酸的微生物活动减弱。乳酸的积累，硝酸盐还原菌活动也受到抑制，同时形成的亚硝酸盐又被分解，亚硝酸盐含量表现为先上升后下降的趋势。此时泡菜有酸味且清香，为泡菜完全成熟阶段。,泡菜发酵的过程分析 发酵后期： 发酵持续进行，乳酸含量继续增加，使乳酸菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐缓慢直至停止。乳酸菌数量开始下降，硝酸盐还原菌完全被抑制。此时，泡菜的酸

17、度过高，风味不协调。,微生物培养的利用,利用微生物进行发酵来生产特定的产物： 5、利用放线菌、霉菌生产抗生素 6、转基因工程菌的培养，获得特殊代谢产物或菌体、治理环境污染,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。自然界中，亚硝酸盐分布广泛。 据统计蔬菜中亚硝酸盐的平均含量约为4mg/kg ，咸菜中亚硝酸盐的平均含量在7mg/kg以上，而豆粉中的平均含量可达10mg/kg。,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.30.5g时，会引起中毒；当摄入总量达到3g时，会引起死亡。 我国卫生

18、标准规定，亚硝酸盐残留量在肉制品中不得超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴幼儿奶粉中不得超过2mg/kg,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,实验原理 在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶联，形成玫瑰红色产物，可用光电比色法定量。 将显色反应后样品与已知浓度的标准液进行目测比对，可以大致估算出样品中亚硝酸盐的含量。,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,实验材料药品： NH4Cl缓冲液： ZnSO4溶液 NaOH溶液 对氨基苯磺酸溶液 N-1-萘基乙二胺溶液 显色剂（对氨基苯磺酸溶液+ N-1-萘基乙二胺溶液、等体积混合）,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,NaNO2标准溶液（测定时用） 用前，取NaNO2标准溶液1.00mL，移至100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释到刻度。此时溶液中亚硝酸盐含量相当于5 g /mL,发酵过程中亚硝酸盐含量的测定,基本操作步骤 1、样品处理： 泡菜25g+少量泡菜汁打成匀浆、过滤、留滤液；