流式细胞术.ppt

1、流式细胞术,（ Flow Cytometry ,FCM）,利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。,荧光信号主要包括两部分：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。,标本处理,免疫荧光标记 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记,流式细胞术常规检测时的样品制备,（一）直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X1

2、06细胞ml)，在每一管中分别加入50l的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入) 。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7274)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。,直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。,(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体

3、，生成抗原抗体抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。,本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。,最小化非特异性结合的方法,常用的荧光染料（488波长激发）,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫

4、荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 7AAD 488 675 区分死细胞 其中PE最强，使用于弱表达抗原 FITC最便宜，使用于强表达抗原,培养细胞,制作细胞悬液 300-400目滤网过滤 免疫荧光标记 上机,流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨,应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=263.63,P0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多

5、(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P0.001).EDTA组、细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光强度表达差异无统计学意义(P0.05).结论:EDTA联合细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法,操作步骤,制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640调整细胞浓度为51010ml取40l细胞悬液加入预先有特异性McAb(550l)的小玻璃管或塑料离心管，再加50l 120(用DPBS稀释)灭活正常兔血清4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左

6、右1000rpm5min弃上清，加入50l工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm5min加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500l固定液)FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存57天),1. DPBS (10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNaHPO 11.5g 临用时用蒸馏水110稀释KHPO 2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5)4NaN50ml (终浓度0.2)3.固定液DP

7、BS1000ml葡萄糖20g (终浓度2)甲醛10mlNaN0.2g (终浓度0.02),注意事项,1.整个操作在4下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。,注意事项,细胞数目，标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在100-200微升。 必须经过微栅过滤。 培养细胞类型，大小。 注意孵育条件，试剂说明上都有标记，

8、大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4条件下孵育。 阴性对照。,血细胞 流式检测,抗凝。 除红细胞标记检测外需要溶血。 血标本取出后6小时内进行荧光染料标记，溶血固定后（含多聚甲醛）可保存2-3天。 注意孵育环境，试剂说明上都有标记，大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4条件下孵育。 标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在100-200微升。 如血标本中有血凝块或其他絮状物、沉淀不可上机检测，以防止堵塞流路通道。,氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,),贮存液(10)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(

9、100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4oC保存6个月以内 工作液(1)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存 注: 1) 贮存液不可小于10, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代,用氯化铵溶血剂的溶血方法,100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育1015分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上机检测,细胞

10、凋亡 流式检测,固定细胞的染色方法 非固定细胞的染色方法,固定细胞的染色方法,PI单染色法 （1）,1收集细胞（15）106个，5001000r/min离心5min，弃去培养液。 23ml PBS洗一次。 3离心去PBS，加入冰预冷的70的乙醇固定，4，1h。 4离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 5400目的筛网过滤1次，5001000r/min离心5min，弃去PBS。 6用1ml PI染液，4避光30min。 7流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。,PI单染

11、色法 （2）,1收集细胞（1106个），5001000r/min离心5min，弃去培养液。 21ml PBS/FCS洗一次。 35001000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500l PBS/FCS和500l的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4下固定4min。 45001000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2 Tween的PBS 1ml，37孵育15min。 51ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 6400目的筛网过滤1次。 75001000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪

12、分析。,调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析,1离心收集细胞，PBS洗12次。 21多聚甲醛低温下固定15min。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱内放置13天。 4PBS轻洗1次 5细胞与TdT标记液37孵育，时间12h。 6PBS轻洗1次。 7细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS轻洗1次。 91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 10 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。,ISNT的流式细胞仪分析,1离心收集细胞，PBS洗12次 21多聚甲醛低温下固定15mi

13、n。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱内放置13天。 4PBS轻洗1次。 52105细胞与12.5l的缺口平移缓冲液在15共孵育6h，每过15min振动1次。 6PBS轻洗1次。 7细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS轻洗1次。 91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 10 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图,非固定细胞的染色方法,Hoechst 33342/PI双染色法,1悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1g/ml；帖壁生长的细

14、胞用含有0.02EDTA的0.25胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1g/ml，37孵育710min。 24 5001000r/min离心弃去染液。 3加入1.0ml PI染液，4避光染色15min。 4400目的筛网过滤1次。 5流式细胞仪分析。,Annexin V/PI双染色法,1细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（15）106，5001000r/min离心5min弃去

15、培养液。 2用孵育缓冲液洗1次，5001000r/min离心5min。 3用100l的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。 45001000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。 5加入荧光溶液4下孵育20min，避光并不时振动。,细胞因子检测,常用的标本类型和处理方法 全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内

16、分析。 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，调节细胞浓度为2106细胞/ml。 细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2106细胞/mL于新鲜培养基中。 冰冻全血与PBMCs：使用1红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，70冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上23mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。,流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）,1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂

17、，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37，5%二氧化碳培养4-6小时 2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。 对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断 3、细胞表面染色 加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟； 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会

18、溶血不完全。） 离心500g 5分钟，弃上清 4、固定和破膜 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清； 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书） 加23mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。 5、细胞内染色 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。 加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机,流式细胞术分析血小板,全血样本的制备 1.抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。 2.Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 3.1%多聚甲醛固定样本。 4.上机检测,质控标本,.阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。 2.血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。 3.血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。 4.血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血