细胞培养.ppt

1、细胞培养技术,第一部分 理论部分 第二部分 细胞培养 第三部分 MDCK细胞培养,第一部分 理论部分,第一部分 理论部分,内容： 1.基本概念 2.细胞的生命过程 3.细胞的生长方式及类型 4.细胞生长的条件,1.基本概念,1.基本概念 1.1细胞培养 (cell culture)：将生物体内的部分组织移出体外，在人工控制的条件下，对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行体外培养，使其正常生长繁殖的技术。 细胞培养包括动物细胞培养与植物细胞培养,1.基本概念,1.2区别 细胞培养：使用单细胞悬液 组织培养：使用组织块（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用活体器官的一部分

2、或整个器官于体外培养，并保持其一定的结构与功能特征,1.基本概念,1.3原代培养与传代 1.3.1原代培养 源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。 1.3.2传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 细胞系(cell line)： 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。,2.细胞的生命过程,2.细胞的生命过程 单个细胞的生长 细胞系的生命过程,2.细胞的生命过程,2.细胞的生命过程 2.1单个细胞的生长,细胞周期,间期,有丝分裂期(M期),G1期（DNA合成前期）,S期（DNA合成期）,G2期（DNA合成后期）,2.细胞的

3、生命过程,2.2细胞系的生命过程,原代培养期,传代期,衰退期,为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。,原代培养的细胞生长一定时间达到一定量之后，将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系,有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。,2.细胞的生命过程,2.3细胞系： 有限细胞系: 细胞系的生存期有限 无限细胞系:已获无限繁殖能力、能持续生存的细胞系 （1）只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性转化细胞系 （2）不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化 恶性转化细胞系 细胞株(

4、cell strain) 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,2.细胞的生命过程,3.细胞的生长方式及类型,3.细胞的生长方式及类型 3.1按生长方式，细胞可分为：贴附生长型细胞和悬浮生长型细胞。 3.2每代贴附生长细胞传代后的生长过程： 游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,3.细胞的生长方式及类型,3.2.1游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。持续数分钟至数小时。 3.2.2贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁生长基

5、质，可促进细胞贴壁。 优质一次性培养瓶细胞生长面涂有生长基质。,3.细胞的生长方式及类型,3.2.3潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。一般为数小时至一天。 3.2.4对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 3.2.5停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,3.细胞的生长方式及类型,4.细胞生长的条件,4.细胞生长的条件 4.1营养需要 4.2细胞的生存环境 4.3无污染及无毒,4.细胞生长的条件,4.1营养需要 4.1.1基本营养物质 氨基酸、维生素、碳水化物、无机离子 4.1.2促生长物质,4.细胞生长的条件,

6、4.2细胞的生存环境 温度 氧气 二氧化碳 代谢 维持pH CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- 渗透压 4.3无污染及无毒,第二部分 细胞培养,第二部分 细胞培养,内容： 1.实验室设备准备 2.细胞培养用品的准备与灭菌 3.细胞培养用液及培养基 4.细胞培养的基本技术,1.细胞培养实验室的设备,1.1仪器 生物安全柜（超净工作台）、CO2培养箱、倒置显微镜、普通显微镜、冰箱、液氮罐、离心机及天平、高压灭菌锅 干燥箱、纯水系统 1.2耗材 培养瓶、培养皿、细胞培养板、吸管、微量加样器吸尖、微孔过滤器、离心管、注射器等。 建议使用质量可靠的一次性已灭菌耗材,2.细胞培养用品的准备

7、,需要清洗的培养用品： 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗,2.细胞培养用品的准备,2.1玻璃器皿 新购置的器皿先去灰尘，去碱、油脂，再做常规处理 常规处理：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗 灭菌：160 2h/121 20min 2.2胶塞 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规处理：浸泡，碱处理，冲洗 灭菌：121 20min 2.3塑料制品，多为一次性物品 常规处理：浸泡，酸处理，冲洗 灭菌：紫外线、辐照,3.细胞培养用液及培养基,3.1水 新制备的三蒸水或18M超纯水 商品化细胞培养级水(cell culture grade water) 所有细胞培养相关

8、液体都用上述水配置 （玻璃器皿、胶塞、塑料制品） 3.2盐溶液 PBS D-Hanks,3.细胞培养用液及培养基,3.3消化液 胰蛋白酶： 胰蛋白酶干粉，以PBS或D-Hanks配制，常用浓度0.25%；胰蛋白酶液体成品。 血清中和 EDTA：通常用EDTA-Na，以PBS或D-Hanks配制，常用浓度0.02%，螯合Ca2+、Mg2+，不被血清中和。,3.细胞培养用液及培养基,3.4抗生素 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，预防培养基污染 通常两种及以上抗生素联用：G-及G+菌 青霉素：G+ 链霉素：广谱 庆大霉素：广谱，主要针对G- 其他：卡那霉素、制霉菌素等,3.细胞培养用液及培养

9、基,3.5其他添加物质 L-谷氨酰胺 作用？ L？ 丙酮酸钠 作用？ 牛血清白蛋白组分V 作用？ HEPES 作用？,3.细胞培养用液及培养基,3.6培养基（液） 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 3.6.1天然培养基： 如：血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：（1）来源受限 （2）成分复杂（3）易发生支原体污染,3.细胞培养用液及培养基,3.6.2合成培养基 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 主要成份

10、包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 干粉产品：干粉完全溶于约950ml三蒸水，NaHCO3调pH至7.2，定容至1000ml,0.22m过滤备用。 液体成品：直接使用 优点：标准化生产，组分和含量相对固定成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要,3.细胞培养用液及培养基,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）,3.细胞培养用液及培养基,血清 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,3.细

11、胞培养用液及培养基,常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活(消除补体活性):56 ,30min 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,3.细胞培养用液及培养基,完全培养基 必要组分 合成培养基 胎牛血清 2-20(2-5%维持液 10-15%生长液) 青霉素 终浓度100U/m

12、l 链霉素 终浓度100g /ml L-谷氨酰胺 终浓度0.01-0.03% 可选组分 HEPES、牛血清白蛋白组分V、丙酮酸钠等,3.细胞培养用液及培养基,完全培养基 *调pH至7.2 *无菌检查,4.细胞培养的基本技术,4.1无菌操作技术 包括：培养前准备、无菌室与超净台（生物安全柜）的消毒、洗手与着装、操作过程中的无菌意识等 无毒、无污染是细胞培养技术的关键之一 无毒：凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。 可能发生污染的来源有：培养用液及培养基、器皿耗材、细胞本身、工作者本身、空气等,4.细胞培养的基本技术,4.1无菌操作技术,污染,微生物污染,细胞间交叉污染,细菌污染 霉菌污染

13、 支原体污染 ,4.细胞培养的基本技术,扫描电镜法显示支原体污染,4.细胞培养的基本技术,4.2细胞培养 原代细胞培养 细胞系株培养,4.细胞培养的基本技术,4.3细胞复苏 仪器：生物安全柜、离心机及天平、水浴锅热水 试剂：10%血清完全培养基 耗材：移液管1ml/10ml、 细胞培养瓶 步骤：,操作间及个人准备,液氮罐内取出细胞,生物安全柜,试剂耗材准备,水浴 (37-40 ),1min内融化 速融,低速离心5-10min,弃上清液,生长液重悬,转移入培养瓶，培养,70%乙醇表面消毒,4.细胞培养的基本技术,4.4 细胞传代 仪器：生物安全柜、37 培养箱、倒置显微镜、普通显微镜 试剂：10

14、%血清完全培养基、消化液、PBS或D-Hanks液 耗材：移液管1ml/10ml、 细胞培养瓶 其他：生长到一定浓度密度的细胞、细胞计数板,4.细胞培养的基本技术,步骤：根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 4.4.1 悬浮生长细胞传代 将细胞转移至离心管，低速离心，弃上清，细胞用新鲜生长液重悬后传代。 自然沉淀细胞，将培养液上清去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 4.4.2 半悬浮(半贴壁)生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长，但贴壁不牢，可直接吹打使细胞从瓶壁脱落下来，吹打成细胞悬液后进行传代。,4.细胞培养的基本技术,4.4.3 贴附生长细胞传代（以胰蛋白酶传T

15、25细胞瓶为例） 弃培养瓶中上清PBS或D-Hanks洗涤细胞两遍加入1ml胰酶（以刚好能覆盖瓶底为宜）于37 静置2-10min（显微镜下动态监测）加入完全培养基中止消化吸管吸取培养液吹打细胞成单细胞悬液细胞计数、归正分瓶培养 EDTA消化？,4.细胞培养的基本技术,4.4.4细胞计数（血球计数板计数法）,4.细胞培养的基本技术,4.4.4细胞计数（血球计数板计数法）,4.细胞培养的基本技术,4.4.4细胞计数（血球计数板计数法）,4.细胞培养的基本技术,4.5 细胞观察 开始细胞培养后需每日进行观察 培养液 细胞生长情况 细胞形态变化 污染,第三部分 MDCK细胞培养,用于流感病毒研究的细

16、胞 原代细胞:如人胚肾细胞、猴肾细胞、鸡胚肾二倍体细胞 传代细胞：如非洲绿猴肾细胞（Vero cells）、狗肾传代细胞（MDCK）、牛肾传代细胞（MDBK）,生物安全,MDCK细胞培养实验室生物安全级别：二级生物安全实验室(BSL-2),MDCK细胞培养材料准备 MDCK细胞传代 MDCK细胞复苏与冻存 MDCK细胞敏感性实验,1. MDCK细胞培养材料准备材料准备,1.1 试剂 1.1.1培养基：RPMI 1640 500ml/瓶 1.1.2胎牛血清，灭活? 温度 时间？ 1.1.3抗生素母液（双抗） 青霉素G 10000 U/ml 硫酸链霉素10000 g/ml 使用时以1ml:100m

17、l比例加入完全培养液，终浓度100U(g)/ml。 分装后保存于-20 ,不得反复冻融,2. MDCK细胞培养材料准备材料准备,1.1.4消化液 胰蛋白酶(Trypsin) 100ml/瓶 1.1.5牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液。 1.1.6 HEPES 缓冲液, 1mol/L 母液 1.2耗材 1.2.1 1ml 、10ml无菌移液管 1.2.2 细胞培养瓶 (T-25或T-75) 1.2.3 离心管 1.2.4 冻存管,1. MDCK细胞培养材料准备材料准备,1.3完全培养液配制 1.3.1 RPMI 1640 1瓶（500ml） 双抗母液 5ml HEPES缓冲液 12.5 ml

18、7.5%牛血清白蛋白组分V 12.5 ml 混匀 1.3.2 胎牛血清10ml+90ml 1.3.1液体，即为10%完全培养液（生长液）,2.MDCK细胞传代,2.1仪器：生物安全柜、离心机及天平、水浴锅热水、70%酒精 2.2试剂：10%血清完全培养基（生长液）、胰酶（37水浴预热） 2.3耗材：移液管10ml、 细胞培养瓶 2.4步骤： 2.4.1弃T-75瓶内陈旧培养液，加5ml预热的胰酶 2.4.2温和地摇动细胞瓶1分钟，使胰酶均匀分布在整个细胞薄层。弃去胰酶 2.4.3加入5ml预热的胰酶，重复2.4.2,2.MDCK细胞传代,2.4步骤： 2.4.4 加1 ml胰酶，使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶至细胞从培养瓶内面分离（约510min）。 2.4.5加入10ml生长液并用移液管轻轻吹打分散细胞团。再加入90ml生长液，吹打混匀（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）。 2.4.6每个T-25细胞瓶加入6ml细胞，剩余细胞加T-75传代。 2.4.7细胞置37培养，每日观察。长至75-90%成片时，用于病毒分离实验。,3. MDCK细胞冻存与复苏,3.1细胞冻存 3.1.1材料： 成片的MDCK细胞：生长良好存活率高，8090成片。 二甲基亚砜（DMSO） 胎牛血清 胰蛋白酶 移液管：1ml,10ml