分子生物学-真核基因表达调控

1、第八章 基因的表达与调控(下) 真核基因表达调控的一般规律,主要内容,真核生物的基因结构与活性 真核生物基因表达调控的特点和种类 真核生物DNA水平上的基因表达调控 真核生物转录水平上的基因表达调控 真核基因转录后水平上的调控,一、真核基因组结构特点,真核基因组结构庞大 3109bp、染色质、核膜 单顺反子 基因不连续性 断裂基因（interrupted gene）、 内含子(intron)、外显子(exon) 非编码区较多 多于编码序列(9:1) 含有大量重复序列,第一节 真核生物的基因结构与活性,基因组很小，大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元多顺反子 有重叠基因,原核生物基因组结构

2、特点:,二、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异,思考题：试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？, 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。, 真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。, 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。, 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。,在真核生物中，基因转录的调节区

3、相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。 在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。, 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。, 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。,三、基本概念,（一）基因家族（gene family),真核生物的基因组中有很多来源相同、结构相似、功能相关的基因，将这些基因称

4、为基因家族。,同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇(gene cluster) 。,如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都属于基因家族,1、简单多基因家族 简单多基因家族中的基因一般以串联方式前后相连。,The eukaryotic ribosomal DNA repeating unit,2、复杂多基因家族,复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。现已发现存在不同形式的复杂多基因家族。,Organization of histone genes in the animal genome,（二）断裂基因,基因的编码序列在

5、DNA分子上是不连续的，为非编码序列所隔开，其中编码的序列称为外显子，非编码序列称内含子。,外显子(Exon) ：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。 内含子(Intron) ：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。,1、外显子与内含子的连接区,指外显子和内含子的交界或称边界序列，它有两个重要特征： 内含子的两端序列之间没有广泛的同源性 连接区序列很短，高度保守，是RNA剪接的信号序列 5GUAG 3,2、外显子与内含子的可变调控,组成型剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA。 选择性剪接：同一基

6、因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。,(三)假基因,是基因组中因突变而失活的基因，无蛋白质产物。一般是启动子出现问题。,第二节 真核生物基因表达调控的特点和种类,一、真核生物基因表达调控的特点 1、RNA聚合酶对基因具有选择性 2、调控具有多层次性 3、个体发育复杂同基因表达密切相关 4、活性染色体结构变化影响基因转录活性 5、正性调节占主导 6、转录与翻译间隔进行 7、转录后修饰、加工,转录后水平的调节,真核生物基因表达调控的层次： 1、DNA水平调节 2、转录水平调节 3、转录后水平的调节 RNA加工成熟过程调节 翻译水平调节 蛋白质加工水平的调节,DNA,转录初产物RNA,m

7、RNA,蛋白质前体,mRNA降解物,活性蛋白质,DNA水平调节,转录水平调节,翻译调节,mRNA降解的调节,翻译后加工的调节,核,细胞质,蛋白质降解的调节,根据其性质可分为两大类：,一是瞬时调控或称为可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种底物或激素水平升降时，及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。,二是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。,根据基因调控在同一事件中发生的先后次序又可分为：,DNA水平调控转录水平调控转录后水平调控 翻译水平调控蛋白质加工水平的调控,二、真核生物基因表达调控的种类：,第三

8、节 真核生物DNA水平上的基因表达调控,基因丢失,基因扩增,基因重排,DNA甲基化状态与调控,染色体结构与调控,一、基因丢失,在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。 目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。,二、基因扩增,基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。 如非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDN

9、A）约500个拷贝。卵裂期和胚胎期，需要大量的rRNA，基因会大量复制rDNA，使拷贝数达到200万，扩增约4000倍。 非洲爪蟾体细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象。,基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。,发育或系统发生中的倍性增加在植物中普遍存在,DNA含量的发育控制 利用流式细胞仪对从拟南芥不同发育阶段的组织中分离到的间期细胞核进行分析，发现多倍体的DNA含量与组织的成熟程度成正比。对于一给定的物种，C是单倍体基因组中的DNA含量。,将一个基因从

10、远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。 通过基因的转座，DNA的断裂错接而使正常基因顺序发生改变。 重排可以产生新基因，而这些基因的表达是特定环境下所必需的。 重排也许负责从先前存在的一条基因的表达转换到另一条基因的表达，这种方式提供了基因表达调控的一种机制。 通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。,三、基因重排,免疫球蛋白基因定位,编码一条Ig多肽链的基因是由胚系中数个分隔开的DNA片段（基因片段）经重排而形成。,重链可变区基因是由V、D、J三种基因片段经重排后所形成。,在Ig重链基因重排后，轻链的可变区基因片段随之发生重排，V与J基

11、因片段并列在一起。 轻链基因先发生重排，如果基因重排无效，随即发生基因的重排。,重排机制,参与V/（D）/J基因重组过程的酶称为V/（D）/J重组酶。 重组酶作用的特点是： （1）淋巴细胞特异性，这可能解释了Ig基因的重排仅见于B淋巴细胞。 （2）重组酶发挥其功能仅限于B细胞发育早期。,V/（D）/J重组酶识别与Ig基因片段重排有关的特殊序列，称为重组信号序列(RSS)，位于V基因片段的3端与J基因片段的5端之间以及D基因片段的两侧。,（1）高度保守的回文结构的七聚体（palindromic heptamer); （2）较少保守、富含A/T的九聚体(nonamer); （3）七聚体和九聚体之间

12、不保守的间隔序列（spacer sequence)， 含有121碱基对或231碱基对。,这些识别信号包括三部分：,四、DNA的甲基化与基因调控：,1、DNA的甲基化,DNA甲基化修饰途径存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。大量研究表明，DNA甲基化能关闭某些基因的活性。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,DNA甲基化修饰过程通过改变基因的表达，参与细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。 DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。,D

13、NA的甲基化,在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中,CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，CpG岛,真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：,日常型甲基转移酶,从头合成型甲基转移酶,日常型甲基转移酶 作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链, 使其完全甲基化, 可参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化。 从头合成型甲基转移酶, 它可甲基化CPG, 使其半甲基化, 继而全甲基化。从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控, 其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。,2、DNA甲基化抑制基因转录的机理,DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影

14、响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。,五、染色质结构与基因表达调控：,按功能状态的不同可将染色质分为活性染色质和非活性染色质，所谓活性染色质是指具有转录活性的染色质；非活性染色质是指没有转录活性的染色质。 活性染色质由于核小体构型发生构象的改变，往往具有疏松的染色质结构从而便于转录调控因子与顺式调控元件结合和RNA聚合酶在转录模板上滑动。,活性染色质,真核细胞中基因转录的模板是染色质而不是裸露的DNA，因此染色质呈疏松或紧密结构，即是否处于活化状态是决定RNA聚合酶能否有效行使转录功能的关键。,一个灯刷染色体正在转录,多线染色体有许多带,果蝇（唾液腺细胞）多线

15、染色体有众多的带,灯刷和多线染色体这些性质表明了一个普遍的结论：为进行转录，遗传物质需要从更致密包装的状态变为松散状态。,RNA聚合酶在到达与组蛋白八聚体缠绕在一起的DNA时，可能会遇到阻力。,RNA聚合酶与核小体的大小比较,基因转录前染色质必须历经结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重建。,如果核小体在启动子处形成（RNA聚合酶）就不能结合；如果转录因子（和RNA聚合酶）结合于启动子，并建立了用于起始的稳定复合体，则组蛋白就被排斥在外。,占先模型：,染色质转录的动力学模型依赖于一些因子，它使用由ATP水解所提供的能量，替代特定DNA序列的核小体

16、。,动力学模型：,转录置换了组蛋白八聚体,实验表明，在DNA中，组蛋白八聚体被置换，并重新结合在新位置。,RNA聚合酶前进时，在DNA中，组蛋白八聚体被它所置换。DNA重新成环，结合（到聚合酶或八聚体）并连接形成一个封闭区域。而它可能与DNA和（或）聚合酶相连接，并在聚合酶之后插入到DNA中。,活性染色质的主要特点,在结构上：,活性染色质上具有DNaseI超敏感位点 活性染色质上具有基因座控制区（LCR) 活性染色质上具有核基质结合区（MAR序列）,活性染色质上具有DNaseI超敏感位点。每个活跃表达的基因都有一个或几个超敏感位点，大部分位于基因5端启动子区域。,活性染色质上具有基因座控制区(

17、locus control region)。基因5端调控位点是主要的调控因子，含有这些超敏位点的簇称为LCR 。删除5端LCR可以恢复整个区域对DNA酶的正常抗性。两个关于LCR如何作用的模型表明活化启动子需要LCR的作用，它可增强启动子的转录强度。,珠蛋白结构域的两末端被标上了超敏位点，5端的一组位点组成了LCR，它对这个基因簇的所有基因的表达都是必需的。,活性染色质上具有核基质结合区（matrix attachment region ，MAR）。MAR一般位于DNA放射环或活性转录基因的两端。在外源基因两端接上MAR，可增加基因表达水平10倍以上，说明MAR在基因表达调控中有作用，是一种新

18、的基因调控元件。,尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。 一般来说，组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平，而去乙酰化则抑制基因的转录和表达。,组蛋白修饰是一个重要事件,组蛋白乙酰化激活染色质，组蛋白和DNA的甲基化失活染色质。,基因表达主要调控点是转录起始，而对基因表达的后几个阶段的调控是很少的，它们并不决定基因是否表达，尽管对加工的调节可能决定了mRNA中基因的形式。,第三节 真核生物转录水平上的基因表达调控,一、真核基因转录 （一）真核基因结构,“基因”的分子生物学定义：产生

19、一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。,（二）顺式作用元件 定义：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。 例： 启动子、增强子、沉默子、绝缘子等,（1）增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。,SV40的转录单元上发现，转录起始位点上游约200 bp处有两段长72 bp的正向重复序列。,增强子特点：, 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍, 增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3 kb，或在靶基因下游，均表现出增强效应；,增强子能从上游或下游位置激活启动子，并且与启动子相比，增强子的序列颠倒后仍能起

20、作用。,大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应时所必需的；, 增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明增强子只有与特定的蛋白质（转录因子）相互作用才能发挥其功能；, 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；, 许多增强子还受外部信号的调控； 如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,增强子作用机理：,（2）能阻断激活或失活效应通过的元件称为绝缘子,绝缘子有一种或同时有两种主要特性： 当绝缘子置于增强子和启动子之间的时候，它能阻断增强子对启动子的

21、激活作用。 当绝缘子被置于一条活性基因和异染色质之间时，它能够提供一道屏障来保护基因防备异染色质延伸所带来的失活效应。,增强子能激活它附近的启动子，但激活效应可以被位于两者之间的绝缘子所阻断。,异染色质会从一个中心开始延伸并且阻断任何它所覆盖的启动子。而绝缘子可以成为异染色质传播的屏障从而使启动子保留了活性。,（三）反式作用因子,1、定义：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。,TFD（TATA）、CTF（CAAT）、SP1（GGGCGG）、HSF（热激蛋白启动区）,不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合，这些转录因子通过与基

22、础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同的转录因子，看到的现象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所识别；能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转录因子是通过蛋白质蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的。转录因子之间或转录因子与DNA的结合都会引起构象的变化，从而影响转录的效率。,转录因子可通过几条途径被激活,控制转录因子活性的机制有多种，可以是蛋白质合成、蛋白质共价修饰、配体结合、也可以是影响转录因子与DNA结合甚至是将蛋白质与DNA隔离的各种抑制剂。,2、反式作用因子结构,DNA结合结构域,转录活化结构域,结构域,连接区（二聚

23、化结构域）,转录因子中的DNA结合和激活功能可能组成了蛋白质的独立结构域。,（1）DNA结合结构域：,螺旋-转折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H） 锌指结构（zinc finger） 碱性-亮氨酸拉链（basic - leucine zipper） 碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix /loop /helix，bHLH）,1、螺旋-转折-螺旋,2、锌指结构,配位键,2-9个,是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn构成，形成的结构像手指状。,转录因子SP1 （GC盒） 、连续的3个锌指重复结构。,锌指可以形成-螺旋

24、而插入DNA的大沟中，在另一面连着片层。,3、碱性-亮氨酸拉链,亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链” 。 肽链氨基端2030个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。,这类蛋白质的DNA结合结构域实际是以碱性区 和亮氨酸拉链结构域整体作为基础的。,4、碱性-螺旋-环-螺旋,该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。,(2) 转录激活结构域,酸性激活结构域 如酵母转录因子GAL4转录激活区含有较多负电荷，通过与TFD的作用促进转录起始复合物的组装。

25、富含谷氨酰胺结构域 转录因子SPl，结合GC框 富含脯氨酸结构域 CTF家族C端区（CAAT）,（一）概 述,单细胞生物 直接作出反应,多细胞生物 通过细胞间复杂的信号传递系统来传递信息，从而调控机体活动。,外界环境变化时,信号转导,二、真核基因转录调控的主要模式,跨膜信号转导的一般步骤,特定的细胞释放信息物质,信息物质经扩散或血循环到达靶细胞,与靶细胞的受体特异性结合,受体对信号进行转换并启动细胞内信使系统,靶细胞产生生物学效应,细胞间信息物质是由细胞分泌的调节靶细 胞生命活动的化学物质的统称，又称作第一信使。,如：生长因子、细胞因子、胰岛素等,如：Ca2+、IP3、DAG、cAMP、cGM

26、P等。,第二信使(secondary messenger)：在细胞内传递信息的小分子物质，,能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称 配体(ligand)。,受体的定义：,是细胞膜上或细胞内能特别识别生物活性分子并与之结合的成分。它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。,存在于细胞质膜上的受体，根据其结构和转换信号的方式又分为三大类：离子通道受体，G蛋白偶联受体和跨膜蛋白激酶受体。,1、膜受体(membrane receptor),细胞表面的三类受体,（1）G 蛋白偶联受体 又称七个跨膜螺旋受体/蛇型受体,G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白,

27、 G蛋白(GTP binding protein),是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由、 三个亚基组成。,有两种构象：非活化型；活化型,两种G蛋白的活性型和非活性型的互变,2、胞内受体(membrane receptor),高度可变区,位于N端，具有转录激活功能,DNA结合区,含有锌指结构,激素结合区,位于C端，结合激素、热休克蛋白，使受体二聚化，激活转录,配体：类固醇激素、甲状腺素等,功 能：多为反式作用因子，当与相应配体结合后，能与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。,（二）信号传导途径,1、膜受体介导的信息传递,（1） cAMP - 蛋白激酶途径/,A激酶（PKA）：依赖于cAMP的蛋白激酶。,蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）：由两个催化亚基和两个调节亚基组成，在没有cAMP时，以钝化复合体形式存在。cAMP与调节亚基