南京农业大学考研复习-生物化学-酶学

1、酶 学 (Enzymology) 主讲人： 徐朗莱,2010版硕士入学生物化学考试大纲 酶学主要内容： （一）酶的基本概念和作用特点 (基础) （二）酶的国际分类和命名 (基础) （三）酶的作用机制 1、酶的活性中心 （重点） 2、酶催化（专一性）特性 (基础) 3、酶催化 高效性机制 (难点),2010版硕士入学生物化学考试大纲 （四）影响酶促反应速度的主要因素（重点） （五）别构酶和共价修饰酶 （重点） （六）同工酶 (基础) （七）维生素和辅酶 (基础) （八）酶的分离与纯化（重点）,一、关于酶的定义 ？ - 仅仅说 “酶是生物催化剂” 是不够的 ！,问题主要是涉及酶的化学本质问题,1大

2、多数酶是蛋白质 -Most enzymes are proteins,1926年美国Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质,1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。,J.B.Sumner,J.H.Northrop,但在20世纪80年代，发现某些RNA具有催化活性，酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击！,核酶 ribozyme,1982年T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性 1983年S.Altman等研究RNaseP（20%蛋白质和80%RNA），发现RNaseP中的R

3、NA可催化E. coli tRNA的前体加工,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA,获1989年诺贝尔化学奖,1,Ribozymes （核酶）,Satisfy several enzymatic criteria: substrate specificity, enhance reaction rate, and emerge from reaction unchanged; Several known ribozymes: RNas

4、e P: catalyzes cleavage of precursor tRNA molecules into mature tRNAs; Group I, II introns （内含子）: catalyze their own splicing (cleaving and ligating); Peptidyltransferase (肽酰基转移酶): catalyzes peptidyl transfer reaction (-23SrRNA),What is the difference between an enzyme and a protein?,Protein,All enz

5、ymes are proteins except some RNAs， and not all proteins are enzymes,RNA,Enzymes,所以，关于酶的定义为： 由生物活细胞产生的一类能对特定底物起高效催化作用，由蛋白质或/和核酸组成的具有活性中心特定构象的生物催化剂。,二、酶的催化作用特征 与一般催化剂的共同特征 ？ 与一般催化剂不同的催化特征 ？,酶不共同于一般催化剂的催化特征 1. 酶催化反应的高效性 2. 酶催化作用对象的专一性（特异性） 3. 酶的易变性 4. 酶活性的可调性,酶作用的专一性类型,对酶作用专一性的几个假说 锁钥模式 （1894年, E.Fish

6、er） （lock and key hypothesis） 三点附着学说 （A.Ogster） （three point attachment hypothesis） 诱导契合学说 （1958年,D. Koshland） （induced-fit hypothesis）,为什么现在比较公认的是： “诱导契合学说” ？ 另外注意： 诱导作用是双方的，互相的诱导然后达到双方结合的契合 ！,Lock and Key hypothesis,Induced Fit hypothesis,An Example: Induced conformational change in hexokinase,Cat

7、alyzes phosphorylation of glucose to glucose 6-phosphate during glycolysis such a large change in a proteins conformation is not unusual BUT: not all enzymes undergo such large changes in conformation,三点附着学说 -针对立体专一性,三 酶的命名与分类,如 ：蛋白酶、脲酶、淀粉酶 注意：水解酶的“水解”二字通常可省去！,1. 习惯命名法,底物名 + “酶”,三 酶的分类和命名,1. 习惯命名法,反

8、应类型 + “酶”,如 己糖激酶、乳酸脱氢酶、DNA聚合酶 激酶属于哪一类酶 ？,如 胃蛋白酶,1. 习惯命名法,来源 + 酶,1961年，国际酶学委员会规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：,2. 国际系统命名法,如乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1 第一个“1” 第1大类，即氧化还原酶类； 第二个“1” 第1亚类，供氢体为CHOH； 第三个“1” 第1亚亚类，受氢体为NAD+； 第四个“1” 在亚亚类中的顺序号。,乳酸脱氢酶的编码是： EC1.1.1.27,2. 国际系统命名法,国际酶学委员会建议： 每个酶都给予 2 个名称,系统名能确切地表明底物的化学本质和酶的催化性质，但

9、一般很长，使用不够方便。 如：谷丙转氨酶 -丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 所以，一般叙述时还是采用习惯名。,3 酶的分类,国际酶学委员会将所有酶按它们所催化反应的性质分为六大类,二. 酶的分类,注意：六大类酶的顺序不能有变化！,注意： 裂解(合)酶与合成酶的差异！ Synthase and Synthetase ?,酶催化作用的结构基础 酶的活性部位 （active site） 也称酶的活性中心 （active center）,酶催化作用的结构基础 问： 什么是酶的活性中心？,What is the active site?,The active site of an enzyme is th

10、e place where all of the action occurs. It contains the functional groups (amino acid side chains) that bind the substrate(s) and catalyze its conversion to product(s).,酶的活性中心（active center）定义 也称酶的活性部位（active site） - 酶分子中少数几个在一级结构上通常不是邻近氨基酸残基构成的，能与底物结合并与酶的催化作用直接有关的部位。,问： 酶活性中心存在什么结构特点？,酶活性中心的结构特点,1

11、活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。 某些酶活性部位的AA残基 酶 AA残基数 活性部位的AA残基 核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41 溶菌酶 129 Asp52, Glu35 胰凝乳蛋白酶 241 His57, Asp102, Ser195 胃蛋白酶 348 Asp32, Asp215 木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159 羧肽酶A 307 Arg127, Glu270,Tyr248,Zn2+,The active site in each serine protease includes a serine resid

12、ue, a histidineresidue, 需要别（变）构剂（allosteric effectors），该化合物能与别（变）构酶结合，然后引起酶的构象和催化活性发生相应的变化。 现已证明上述观点是正确的。 别（变）构剂，也称效应物或调节物。,1. 大都是寡聚酶，含有两个或两个以上的 亚基。 酶分子上含两个中心或部位： 活性中心（活性部位） 别构中心（别构部位） 具有别构效应-别构剂与别构酶结合，然后 引起该酶的构象和催化活性发生相应的变化。 很多别构酶的动力学曲线呈S形曲线 不是MM形曲线,（2）别构酶的特点:,（3）别构酶的种类 1 同促别构酶 当一种变构剂（通常为底物）与酶分子结合后

13、，引 发酶分子构象的改变，从而改变后续相同化合物（底物）与酶分子结合亲合力的别构酶。 2 异促别构酶 当变构剂（不是底物或产物）与酶分子中一个亚基结合后，引发酶分子构象改变，从而改变后另外化合物（通常为底物）与酶分子结合亲合力的别构酶。,（4）别构效应的种类 正协同效应 上述别构作用中能使酶与底物结合亲合力 发生提高的效应 2 负协同效应 上述别构作用中能使酶与底物结合亲合力 发生降低的效应。,正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较,The quaternary structure of hemoglobin 1-yellow; 1-light blue; 2-green; 2-dark blue

14、; heme-red,血红蛋白（Hemoglobin，Hb ） 正协同变构作用,22,The quaternary structure of hemoglobin 1-yellow; 1-light blue; 2-green; 2-dark blue; heme-red,血红蛋白（Hemoglobin，Hb ） 正协同变构作用,22,血红蛋白4个 亚基之间有八对盐键相连,8对盐键相连后，脱氧血红蛋白分 子构象受到约束，使脱氧Hb分子构象 更稳定，从而使其对于氧气的亲和力 低于单独的-或-亚基对于氧气的亲 和力。,还有 2，3-二磷酸甘油酸（BPG）与脱氧Hb结合,2, 3 - Bisphos

15、phoglycerate (BPG),BPG中三个负电荷基团分别与血红蛋白中-链上末端NH3+ 、-链Lys（82）上- NH3+ 以及His（143）上的咪唑基以离子键形式相结合。,不结合氧时，Fe突出平面,结合氧时，Fe被拉回平面,Hb中血红素与氧气结合后引起的结构变化。,血红蛋白与O2 结合时引起的三级结构变化 过程大致如下： O2 与亚基血红素中铁先结合-铁进 入血红素卟啉中央小孔-F8 His位移- EF,FG 位移-F 螺旋向H螺旋靠近-原 F 、H螺旋之间空隙减小-Tyr被排出空 隙-羧基端Arg的位置改变-原有的盐 键被破坏。,以上有关结构变化示意图如下：,-亚基氧合后，-亚基

16、与-亚基之间发生 相对位移-原有氢键、盐键破坏- 亚基之间空隙变小- BPG 被挤出空隙- -血红蛋白四级结构完全改变- - 亚基中 E11 Val 侧链位置发生改变， 从而 对氧气的结合的空间障碍不存在- -亚基与O2 的结合变得容易。,血红蛋白四级结构的变化,以上变（别）构作用可用撕邮票的例子来理解,肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线方程 （1）肌红蛋白氧合曲线方程-双曲线方程 由 Mb+O2 MbO2 方程推得：,1 或 Y -1 = - X 所以，肌红蛋白氧合曲线是双曲线 事实上，X Y= K 就是双曲线方程， 或者，我们通过坐标轴旋转（45度）， 也就可以得到： X2- Y2 = K 等轴

17、双曲线的方程形式,血红蛋白氧合曲线方程S形曲线方程 K1 由 Hb+O2 HbO2 ； K2 Hb O2 +O2 Hb（O2）2 ； K3 Hb （O2）2 +O2 Hb（O2）3 ； K4 Hb （O2）3 +O2 Hb（O2）4,得： HbO2 2 Hb（O2）2 K1= K2= 4 Hb O2 ； 3 Hb O2 O2 ； 3 Hb（O2）3 K3= 2 Hb （O2）2 O2 ； 4Hb（O2）4 K4= Hb（ O2 ）3 O2,从而得： HbO2 = 4 K1 Hb O2 Hb（O2）2 = 6 K1 K2 Hb O2 2 Hb （O2）3 = 4 K1 K2 K3Hb O23 H

18、b （O2）4 = K1K2K3 K4 Hb O24,由此可推得方程： 以上方程是S形曲线方程 当方程中的K1=K2=K3=K4=K时， 则： K O2 Y= 1+ K O2 以上方程变成双曲线方程。,负协同效应别构酶与米氏酶动力学曲线比较,为了解释别构酶的动力学机理，提出了相关的二种变化模型： 1）齐变模型 2）序变模型,A 齐变模型（也称对称或协同模型、 Symmetry or concerted model, MWC模型）,1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。,该模型的要点 :,B 序变模型（sequential model，也称KNF模型）,1966年由Koshl

19、and、Nemethy和Filmer提出。,该模型的要点 :,2 酶的活性的可逆共价修饰调节 （1）可逆的共价修饰的方式 常见的有： 磷酸化/脱磷酸化， 腺苷酰化/脱腺苷酰化， 尿苷酰化/脱尿苷酰化, 甲基化/脱甲基化 等类型,典型的例子是动物组织的糖原磷酸化酶,1、糖原磷酸化酶催化的反应,磷酸化/去磷酸化最普遍、最灵敏 是生物体内酶化学修饰的主要形式,2、结构特征,Phosphorylation - an example of regulation by reversible covalent modification of the enzyme,3 Protein kinases cata

20、lyze the phosphorylation of proteins,4 Protein phosphatases remove phosphate groups from phosphorylated proteins,肾上腺素激活肝糖原分解中蛋白质磷酸化的级联反应系统（cascade system） 肾上腺素 腺苷酸环化酶 腺苷酸环化酶 （活性） （无活性） ATP cAMP 蛋白激酶 （无活性） 蛋白激酶 （活性） 磷酸化酶激酶（无活性） 磷酸化酶激酶（活性） 磷酸化酶b （无活性） 磷酸化酶a （活性） 糖原 1-磷酸葡萄糖,（1） 基本概念 催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构

21、和理化性质不完全相同的一组酶。 （2）同工酶之间相同点 催化的反应相同，在酶的分类上相同 （3）同工酶之间不同点 体外： 理化性质 体内： 催化特性、分布的部位、 生物学功能,（二）同工酶（Isozymes）,不同点：体外：理化性质 体内：催化特性、分布的部位、生物学功能,氨基酸的组成和顺序，亚基的种类和组合不同 催化的生化特性不同（Km, toopt, pHopt） 电泳行为不同 组织、器官中分布不同 生理功能不同,如：乳酸脱氢酶 （LDH）Lactate Dehydrogenase,LDH是1959年发现的第一个同工酶。 4个亚基组成的寡聚酶，亚基分为M和H型。 因此，可以装配成五种四聚体

22、： H4(LDH1)、H3M(LDH2)、H2M2(LDH3)、HM3(LDH4)、M4(LDH5) 不同的LDH分布在不同组织中： 例如，脊椎动物心脏中主要是LDH1 (H4) ，而骨骼肌的则是LDH5 (M4) 。,Lactate Dehydrogenase is composed of four monomers,All of the lactate dehydrogenase isozymes catalyze the interconversion between lactate and pyruvate,有利于适应不同的组织、器官的不同生理需要，是代谢调节的一种重要方式。,（4）

23、同工酶的功用：,LDH在心脏等有氧器官中表现为脱氢酶活性，但在肌肉中则起将丙酮酸加氢形成乳酸。,酶活性调节中的反馈调节形式：,（5）研究同工酶的意义： 1 是研究代谢调节、个体发育、细胞分化、分子遗传等方面的有力工具。 2 研究蛋白质结构和功能的好材料。 3 临床医学、农业遗传育种、病理分析上都有重要的应用价值 。,生理及临床意义 在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,Each isozyme of lactate dehydrogenase can be separated by

24、electrophoresis,-,+,酶的活力测定 （1）酶活力（enzyme activity） -酶催化一定化学反应的能力 注意： 确定酶反应的时间，就靠进程曲线来定， 就是要取直线阶段以内的时间，再结合要看 产物生成测定的灵敏度。,（2）酶的活力单位 （1）国际单位（IU，International Unit） 一个国际单位表示为在250C，pHopt，Sopt下，一分钟催化1mol/L底物转变为产物所需的酶量。 （2）卡特尔（Katal，缩写为Kat） 在250C，pHopt，Sopt下，一秒钟催化1mol /L底物转变为产物所需的酶量。 1Kat6107IU ，还可以纳Kat、微K

25、at来进行换算。,（2）酶的活力单位 C 习惯用单位 分母总是时间（1秒、1分钟、1小时） 产物的生成量（重量单位g、mg、g） (摩尔或摩尔的倍数),2009年考研农学联考（生物化学）试题 五、单项选择题: 2236小题，每小题l分，共l5分。下列每题给出的四个选项中,只有一个选项是符合题目要求的。 26 1961年国际酶学委员会规定：特定条件下1分钟内转化1mol底物的酶的量是： A 1U B 1U/mg C 1Kat D 1 IU 27、可使米氏酶Km增大的抑制剂是： A 竞争性抑制剂 B 非竞争性抑制剂 C 反竞争性抑制剂 D 不可逆抑制剂,习惯用单位如 :,乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸

26、的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。,（3） 酶的比活力（specific activity，也称比活性）,比活力：指每mg蛋白质（蛋白氮）所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示。 比活力表示酶的纯度。,比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）,（4）测定酶活力时注意点,（1）应测反应初速度（initial velocity ）,（2）酶的反应速度一般用单位时间 内产物的增加量来表示。,（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。,（4）测定酶反应速度时，应使SE。,（5）测定酶活力的一般方法 终点法（终止法）： 一般测产物的生成量比较好 动力学方法（连续法）： 结果比较准确 ！,酶偶联分析法 (enzyme coupling assay),第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。,P1反应无光吸收或荧光变化，但二酶偶联后, P2反应有光吸收或荧光变化。,例：测己糖激酶的活性,（6） 酶的分离与纯化 一般顺序 1 建立好蛋白质活性的分析、鉴定方法； 2 选取合适的实验材料； 3 优化提取蛋白质的抽提液； 4 分离与纯化方法的小试； 5 正式进行蛋白质分离纯化工作； 6 纯度鉴定、样品保存。,分离纯化