生物化学第4章

1、第四章 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论,二、肽,三、蛋白质一级结构的测定,四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能,五、肽与蛋白质的人工合成,一、蛋白质通论,蛋白质(Protein)是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白质的含量很多，约占人体固体成分的45%，它的分布很广，几乎所有的器官组织都含蛋白质，并且它又与所有的生命活动密切联系。,机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶的作用，而酶的本质就是蛋白质；调节物质代谢的激素有许多也是蛋白质或它的衍生物；其它诸如肌肉的收缩，血液的凝固，免疫功能，组织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子生物学的研究表明，蛋白质在遗传

2、信息的控制、细胞膜的通透性、神经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。,（一）蛋白质的化学组成和分类,单纯蛋白质的元素组成为C 5055%、H 6%7%、O 19%24%、N 13%19%，除此之外还有S 04%。有的蛋白质含有P、I。少数含Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等金属元素。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质，因此，只要测定生物样品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白质大致含量：,蛋白质含量蛋白氮6.25 （凯氏(Kjedahl)定氮法的计算基础）,单纯蛋白质（simple protein)：仅由氨基酸组成，不含其它化学成分

3、。 缀合蛋白质(conjugated protein)：除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基(prosthetic group)或配体(ligand)。,单纯蛋白质 （按溶解度分类）,清蛋白 球蛋白 谷蛋白 谷醇溶蛋白 组蛋白 鱼精蛋白 硬蛋白,缀合蛋白质 （按非氨基酸 成分分类）,糖蛋白 脂蛋白 核蛋白 磷蛋白 金属蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白,单纯蛋白质分类,结合蛋白质分类,蛋白质 （按生物学功能分类）,酶 调节蛋白 转运蛋白 贮存蛋白 收缩和游动蛋白 结构蛋白 支架蛋白 保护和开发蛋白 异常蛋白,（二）蛋白质的形状和大小,形状,纤维状 球状 膜蛋白,蛋白质的

4、相对分子量从大约60001106或更大一些。,单体蛋白质(monomeric protein)：仅由一条多肽链组成。其相对分子量除以110估计氨基酸残基的数目。 寡聚蛋白质(oligomeric protein)：由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基(subunit)。,（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,一级结构(primary structure)：多肽链的氨基酸序列。 二级结构(secondary structure)：多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。 三级结构(tertiary structure)：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲

5、或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。 四级结构(quarternary structure)：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。,四、蛋白质功能的多样性,蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。,蛋白质的生物学功能： 1.催化；2.调节；3.转运；4.贮存；5.运动；6.结构成分； 7.支架作用；8.防御与进攻；9.异常功能；,蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。 生物体最主

6、要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：,二、肽,肽是氨基酸的线性聚合物，常称多肽链（peptide chain）。蛋白质是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子。,（一）肽和肽键的结构,蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。,肽链写法：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。,H2N-丝氨酸-缬氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-谷氨酰氨-COOH,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,（S-V-Y-D-Q）,由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构

7、成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面上。,多肽链可以看成由C串联起来的无数个酰胺平面组成,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型,sp2,sp2,sp2,sp3,共振杂化体,（二）肽的物理和化学性质,短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14范围内，肽键中的亚氨基不能解离。,小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。,肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的氨基、羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而

8、为氨基酸所没有的一个颜色反应。,一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。,（三）天然存在的活性肽,生物体内游离存在着很多活性肽，具有各种特殊的生物学功能。,激素：催产素、加压素、舒缓激肽 抗生素：短杆菌肽、多粘菌素E、放线菌素D 蕈的剧毒毒素：鹅膏蕈碱 还原型谷胱甘肽 鹅肌肽、肌肽,天然肽中含有蛋白质中不存在的-肽键、丙氨酸和D型氨基酸。,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。,（一）蛋白质测序的策略,(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 (2)拆分蛋白质分子的多肽链。 (3)测定多肽链的氨基酸组成。

9、(4)分析多肽链的N末端和C末端残基。 (5)断裂多肽链内的二硫键。 (6)多肽链断裂成肽段。 (7)测定各个肽段的氨基酸顺序。 (8)确定肽段在多肽链中的次序。 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质顺序测定基本方法路线,（二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定,1.N-末端分析,（1）DNFB法； （2）DNS法 （3）PITC法 （4）氨肽酶法,2.C-末端分析,（1）肼解法； （2）还原法 （3）羧肽酶法,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离

10、。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法 （DNS法）,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,

11、氨肽酶(amino peptidases)法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端基氨基酸测定,肼解法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽

12、键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶(carboxypeptidase)法,（三）二硫桥的断裂,断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。,S,S,S,S,S,S,胰岛素,HO-CH2-CH2-SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,（四）氨基酸组成的分析,用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。,氨基酸分析仪图谱,（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,1.酶裂解法,胰蛋白酶

13、(trypsin) 这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1。,为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护Lys残基侧链上的NH2，胰蛋白酶就不会水解Lys竣基参与形成的肽键，只能断裂Arg羧基所形成的肽键；反之，如果用1，2环己二酮修饰Arg的胍基，则胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽键。,如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用丫丙啶处理多肽链样品，这时Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有NH2。这样胰蛋白酶便能

14、断裂Cys羧基端的肽键。,R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。,糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。,肽链,水解位点,R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶(pepsin) 它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适pH，前者是pH2，后者是

15、pH8-9，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。,R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶（thermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。,R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑。,葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcal protease) 当裂解在磷酸缓冲液(pH7.8)中进行的，它能在Glu残基和Asp残基的羧基侧断裂肽键。如果改

16、用碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)或醋酸铵缓冲液(pH4.0)时，则只能断裂Glu残基的羧基侧肽键。,梭菌蛋白酶（clostripain） 专门裂解Arg残基的羧基所形成的肽键。即使在6mol/L尿素中20小时内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。,消化道内几种蛋白酶的专一性,（Phe.Tyr.Trp）,（Arg.Lys）,（脂肪族）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,（Phe. Trp）,2. 化学裂解法,溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。,羟胺能专一性地断裂Asn-Gly之间的肽键。但专一性不很强，如Asn-Leu及Asn-Al

17、a键也能部分裂解。,肽段的分离提纯 多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换纤维素和离子交换萄聚糖柱层析、高效液相色谱、高效薄层层析等方法进行分离提纯。,1.Edman化学降解,（六）肽段氨基酸序列的测定,2.酶降解法,蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶（exopeptidases)，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。然而这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。,3.质谱法 质谱法一次能测的氨基酸残基一般10个

18、左右，但质谱法具有样品用量少，分析速度快的优点。,4.根据核苷酸序列的推定法,推定的依据是“中心法则”。 推定法仍需与直接的氨基酸序列分析相配合，如果没有必需的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正确的密码读框。,（七）肽段在多肽链中次序的决定,示例(十肽的水解),A法水解得到四个小肽： A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-Val B法水解得到三个小肽： B1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr- His-Val 重叠法： Ala-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgTyr-His-Val,

19、（八）二硫桥位置的确定,一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。,+,-,+,-,第二向,第一向,a b,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5 图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,（九）蛋白质序列数据库,由于测定克隆基因的核苷酸序列比测定蛋白质氨基酸的序列更快、更有效，现在大多数蛋白质序列是从核苷酸序列翻译成氨基酸序列。要确定一个新序列，研究者所作的第一件事就是将它与数据库中的其它已知的序列进行比较，确定其中是否存在同源性。,四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能

20、,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,1.同源蛋白质,在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质。,同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性称为序列同源性。,同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，它们的氨基酸序列与那些提取它们的物种的亲缘关系具有同一性。,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,细胞色素C分子中氨基酸残基的差异数目及分歧时间,细胞色素c肽链中27个位置的氨基酸残基对所有已测试的种属都是相同的，表明这些

21、残基是规定细胞色素c的生物活性所必需。例如第14和第17位置上的Cys残基可能保证与辅基血红素连接的必要位置，第70到80位置上的不变肽段可能是细胞色素c与酶相结合的部分。肽链中的可变残基可能是一些“填充”或间隔的区域，氨基酸的变换不影响蛋白质的功能。,在不同种属来源的细胞色素c中，可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。细胞色素c的氨基鼓顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树(evolutionary tree)即系统发生树(phylogenetic tree)。根据进化树不仅可以研究从单细

22、胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧(divergence)时间。,生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,根据细胞色素 C的顺序种属差异建立起来的进化树,圆圈代表进化中的分歧点，支干旁的数字是给定有机体谱系的细胞色素c与其祖先差异的残基数,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,1.氧合血红素蛋白,肌红蛋白、血红蛋白链和链是珠

23、蛋白，它们有很高的序列同源。这种同源关系表明随机突变一级结构方面氨基酸取代和分歧或趋异事件的进化顺序。,2.丝氨酸蛋白酶类,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶显示足够的序列同源性，它们是经过祖先丝氨酸蛋白酶基因的复制而来。,3.一些功能差异很大的蛋白质,溶菌酶和乳清蛋白的功能很少相似，但它们的三级结构却十分相似。根据它们的序列同源性可以推论出它们的进化关系具有共同的起源。,（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂,在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有它的重要生物学意义。它是在生物进化过程中发展起来的，是蛋白质分于的

24、结构与功能具有高度统一性的表现。,1.血液凝固的生物化学原理,血液凝固是一系列复杂的生物化学过程。这一过程的主要环节有二：一是血浆中的凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶(thrombin)；二是血浆中的纤维蛋白原在凝血酶的激活下转变为不溶性纤维蛋白(fibrin)网状结构，使血液变成凝胶。,凝血酶原是一种糖蛋白。在凝血酶原致活物的催化下，凝血酶原分子中的二个肽键(Arg274-Thr275和Arg323-Ile324）发生断裂，释放出分子量力32000的氨基末端片段形成有活性的凝血酶。 凝血酶由二条肽链通过一个二硫键交联而成，一条肽键（A链)含49个残基，另一条肽键含259个残基。,纤维蛋白原分子长46nm，分子量为340 000，属纤维状蛋白质。每一分子含6条肽链，这6条肽链两两相同，分三种类，分别称为链(含600个残基左右)、链(461个残基)和链(410个残基)。整个分子由对称的两部分组成，6条肽链的N末端部分集中在中间。纤维蛋白原分子共含29