分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

1、植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测,高级分子生物学实验课一,实验要求,分组实验 仔细观察、认真操作 不大声喧哗 不迟到早退 有事向课代表请假 按时交实验报告,DNA结构,A T G C,DNA存在形式,与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来,细胞破碎 研磨 膜、组蛋白的分离 CTAB SDS DNA纯化 蛋白变性 去除酚、糖 DNA的沉淀 乙醇 异丙醇,植物DNA提取流程,细胞破碎,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,DNA提取,SDS法 SD

2、S是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。,CTAB法 CTAB (hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/LNaCl）可溶。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。,Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶

3、解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇（PVP）是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB抽提液作用原理,DNA纯化（去杂质）,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖 提取液中加1PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。,实验材料 杨树叶片 试剂 2CTAB抽提液 氯仿：异戊醇(24:1) 异丙醇 70%乙醇,材料与试剂,微量移液器 水浴锅 离心机 电泳仪及电泳槽 凝胶成像

4、仪,仪器用具,常见问题,常见问题,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,电泳原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE） Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,维持合适的pH 具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移 保护DNA不被降解,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,核酸染色剂,溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。,注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,其它染料： GeneFinder、Goldview