免疫学技术和临床课件

1、免疫学技术和临床,美国贝克曼库尔特公司 免疫产品市场部 洪军 2007.4 安徽,内容摘要,什么是免疫分析的表现 免疫分析的基本概念 如何去设计一个免疫分析试剂 免疫分析对临床意义的改变 Access2 介绍,什么是免疫分析的表现,免疫检测的分析表现,准确性 精密度 灵敏度 特异性,检测线性范围 试剂稳定性 定标周期 开瓶效期,免疫分析检测的临床表现,临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:,理想状态,健康人群,疾病人群,灵敏度 100% 特异性 60%,特异性 100% 灵敏度 50%,灵敏度增加 特异性增加,假阴性 假阳性 Cut-off,设置cutoff值在此处 用于筛查分析,设置

2、cutoff值在此处 减少错误诊断带来的高花费,设置cutoff值在此处 为了最少化错误结果,关于分析试剂的检测灵敏度的定义,分析及功能灵敏度 分析灵敏度(Analytical Sensitivity) 使用A点标准品 分析内的测试 最低可辨别0值的功能 分析试剂的理论上的极限 功能灵敏度(Functional Sensitivity) 一系列不同浓度的标准品 分析间的测试,用20%的CV值来分 用来描述分析的临床表现 用人血清分析多于20天,且用多个试剂批号和仪器,分析表现特点: 正常人群参考值和10%CV（功能灵敏度）,免疫分析的基本概念,免疫分析的经典定义,免疫分析（Immunoassa

3、y） 是一种技术用于检测和/或定量,通过一个特殊的只能和被分析物结合的抗体,免疫学测定的中心问题,作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键 如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉须反应的物质，这是分析设计的重中之重 抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解,关于抗体的亲合力,抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求亲合力，效价指抗体的量，亲合力指抗体的质 在非竞争免疫反应的模式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度 在竞争法免疫反应的模式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果 对于样品中的干扰物质,亲合力影响分析

4、的抗干扰的能力,免疫分析的工作定义,免疫分析(Immunoassay) 是一种测试方式,使用特殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的. 通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上 通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前 总是需要去仔细关注一下分析的模式（format）,Access 的技术,免疫分析 - “what” 检测技术 化学发光 分离技术 磁性颗粒 分析模式 灵活,- “how”,分析模式,检测技术,分离技术,检测技术,免疫分析 检测技术(Detection) 有许多可用的方法 应用一些

5、“标记物” 所产生的一些能量进行测定 标记物可以或可以不被激活而产生能量 通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测定 分离技术 分析模式,放射免疫分析(Radioimmunoassay),优势 优秀的灵敏度 较宽的检测线性范围 局限性 标记物的半衰期短 试剂效期短 检测结果的重现性差 每次检测都要做标准曲线 分析的反应时间长，半天2天 发射性污染有害 很难实现自动化检测,荧光,荧光素(Fluorophores) FIA，DELFIA 原理 荧光底物, 4-MUP，或荧光标记物，镧系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+ 吸收光为一个短波长的光，而发射光为一个长波长的光 通过荧光计检测 优势 与R

6、IA具有相似的灵敏度和检测线性范围 避免了RIA对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题 局限性 可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的荧光物质的干扰 需用空白对照，速率法或延迟读数来克服,酶-颜色的变化,酶(Enzymes) - EIA 原理 在免疫分析结束后通过催化所加入的酶底物 典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进行检测 优势 非常容易使用的技术用于一些定性的分析 局限性 对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现 ELISA技术必须每次定标 试剂部分成分要复溶重组 反应时间较长,化学发光,化学发光物质 - CLEIA 原理 不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定, 而移

7、去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构变得不稳定发出光（pH的改变，酶切作用，电激发等） 优势 具备RIA所拥有的优势(灵敏度和宽线性),但排除其缺点 用一个简单的光度计读数 非常低的背景干扰 类型 闪烁(flash), 持续(glow) 发光 发光物质的稳定性 水溶液中的稳定性,化学发光物质,AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)-最稳定的化学发光物质（第三代） 第一代：鲁米那 第二代：丫啶酯类，三联吡啶钌 代表性分析系统 贝克曼库尔特 - Access/Access 2 /DxI800 终点读数, 更稳定,ACCESS化学发光标记物的特点,很宽的检测线性范围

8、可检测到6个数量级(例如: 1 - 100,000 units) 极高的灵敏度 可检测到小到10-21 摩尔/升 很底的背景干扰 对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背景信号 更超强的试剂稳定性 试剂效期 开瓶效期 定标周期,分离技术,免疫分析 检测技术 分离技术(Separation) 有很多方式 典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除 分析模式,技术的创新,磁颗粒包被技术,磁颗粒抗体包被技术 磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系 分析物在磁颗粒表面捕获 磁颗粒在磁场中被清洗 磁颗粒重新悬浮十分容易 优势 快速的反应动力学 较少的样品量 提高检测的灵敏度 极好的批内重

9、显性 可以探针取放，实现自动化,分析模式,免疫分析 检测技术 分离技术 分析模式- 有很多种方式 可定义为分析的 “处方” 设定一个最优化的模式(可变量)去最优化项目的临床应用,分析模式,可变量 夹心法(Sandwich) vs.竞争法(competitive) 标记物的放置 同步(Simultaneous) vs. 分步(sequential) 试剂/样品加入的顺序 孵育的次数(步骤) 清洗分离的次数(步骤) 试剂/样品的体积/浓度 孵育的时间 孵育的温度,Access 的分析模式,基本分析模式 夹心法(Sandwich) 竞争结合(Competitive binding) 试剂的加入，孵育

10、和清洗 同步(Simultaneous) (1步, 1次清洗) 分步(Sequential) (2步, 2次清洗) “Piggyback” (2步, 1次清洗),夹心法分析模式,捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体(labeled antibody) 每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇 分析更特异因为二个抗体同时反应 适合于检测大分子物质,bhCG TSHIgEProlactin FSH LH FerritinHBsAg,竞争法分析模式,只有捕捉抗体 主要针对小分子物质检测 没有足够表面积的分析物去符合 “夹心法” 要求,T3FT3 B12 Di

11、goxin Progesterone T4 FT4 Folate Cortisol Estradiol,如何去设计一个免疫分析试剂,一个免疫分析项目的诞生,里程碑(Milestones) 市场调研确定需求 项目的详细特点要求 确定分析模式 研发和优化 证明分析表现符合项目的详细特点要求 (beta sites, clinical studies) 提交注册,项目临床应用的要求,临床应用(claims) 筛查（Screening） 检测（Detection） 诊断（Diagnosis） 分层（Staging） 预后（Prognosis） 监测（Monitoring）,项目的临床应用与分析表现,必

12、须到达的分析表现特征 灵敏度（Sensitivity） 特异性（Specificity） 精密度（Precision） 线性范围（Dynamic range） 其它,分析模式的选择,需考虑的因素 分析物的特征 体积（竞争法还是夹心法） 浓度（一步法，二步法，反应时间等） 潜在的“钩状效应”（hook effect）- 假阴性 解决的方法可以使用2步法模式 样品量和试剂量的平衡 抗干扰能力 仪器的能力局限性 预处理的要求,试剂原材料的选择,原材料 抗体 标准品 封闭试剂（稀释液） 清洗缓冲液,Y,Y,Y,Y,Y,抗体的选择,单克隆(Monoclonal) 和多克隆( polyclonal) 选择

13、的标准(criteria) 特异性(Specificity) 灵敏度(Sensitivity) 供应能力(Supply) 相关性(Correlation) 可制造性(Manufacturability) 花费(Cost),多克隆抗体(Polyclonal Antibodies),免疫动物获得,如羊或兔 时间长,复杂的制作流程 注射,监测滴度(可能反复注射) 周期性的抽血获得 特征化(Characterization)和纯化(purification) 生产出”鸡尾酒”式的抗体,针对所有抗原决定簇 适合对临床灵敏度要求较高分析测试,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,单克

14、隆抗体(Monoclonal antibodies),克隆的结果 抗体的产生具有高度的同源性和特异性并针对一个抗原决定簇 可以选择最好的抗体 在大量生产时可以确保持续的供应 适合对临床特异性和批间一致性要求较高的分析测试,抗体的选择,筛选 抗体需经过灵敏度，特异性和稳定性的评价 许多的抗原决定簇并非一种分子所独有 被测抗原的稳定性不同 被测抗原的游离和结合模式,案例: hLH 抗原位点图,Beta,Alpha,B-D 1 hTSH hCG,B-D 2 hCG,A-D 1 hCG hFSH hTSH,B-D 3,A-D 3,A-D 2 hCG hFSH hTSH,案例: Troponin-I 抗

15、原位点图,肌钙蛋白 - I 稳定性的问题 氧化的问题 磷酸化的问题,N-terminal,C-terminal,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,P,O,O,_,_,Access 1st Gen,31-34,58-70 (cross-react),157-160,PMP,Detect,Access AccuTnI,_,_,24-40,41-49,PMP,Detect,抗体的选择,等分子(Equimolar) vs. 非等分子(non-equimolar)分析 依赖于特异性抗体的选择,

16、结合模式 -一些位点被隐藏,游离模式 -所有位点都暴露,PSA,ACT,PSA,嗜异性抗体(Heterophile Antibody),病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊) 来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗 分析的干扰 可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性 可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性,嗜异性抗体反应,假阳性 较多见 嗜异性抗体在捕捉抗体和检测抗体中搭桥,出现在双单克隆夹心法模式中,嗜异性抗体反应,假阴性 较少见 嗜异性抗体争夺捕捉或检测抗体的抗原结合位点,出现在单克隆/多克隆分析模式中,稀释液,封闭剂（稀释液）可以加在反应基质中或整合在

17、试剂盒内 动物蛋白（鼠，兔，羊等） 各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！,定标程序,厂家产生的主定标曲线 感觉节省的校正型 2 点定标 会增加定标的频率 对非线性的标准曲线可能会有问题(大多数的免疫分析产生的是非线性的标准曲线) 多点定标曲线 定量 典型的是6个水平, 定性 典型的是2个水平 可以达到最大的灵敏度,准确性和精密度 可以有更长的定标周期间隔,标准品 参比物,参比物 纯化蛋白(Purified protein) 通常制作较便宜 相对较短的稳定时间,需特殊的存放条件 一般需要冻干保存 可能会有批间的不一致性 重组(Recombinant) 相对昂贵

18、很长的研发时间 更稳定和可靠 可以以液体的模式供应,分析清洗液,清洗液使用的类型和量，在清洗步骤结束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗残留的有效去除能力等，都会影响到分析表现 清洗液中加入适当的表面活性剂可以去除不需要的生物活性物质 (干扰物质),免疫反应中不能用水进行分析内的清洗分离!,试剂的优化,需优化参数 时间 程序步骤 各类试剂浓度 pH/离子强度 需优化的内容 扩散的速率 结合的速率 复合物的稳定性,优化后达到的表现 灵敏度(Sensitivity) 精密度(Precision) 线性范围(Dynamic range) 准确性(Accuracy) 相关性(Correlation),试验设计选择对临床检测结果的影响,临床试验结果反映了试验过程中各种条件的优化,免疫分析设计及优化,开发免疫分析试剂盒的过程就是选择并优化各种实验条件，达到预期结果并能准确反应临床真实情况的过程,抗原/抗体,分析模式,分离技术,检测技术,总体分析表现,Beckman Access AccuTn