光学显微镜 1

1、第一部分 形貌分析,任何固体，首先遇到的问题是其形貌，对其研究是重要的。形貌有宏观和微观两种，在这一部分中，我们将对物体表面形貌的观察方法进行较为深入的探讨。讲述的主要内容为：,光学显微镜 电子显微镜 扫描探针显微镜,第一章 光学显微镜,第一节 引 言,1886年，Abbe设计高级消色差物镜，,无像差大NA物镜出现（ *NA 为数值孔径）,1893年，Kohler提出照明方式，充分利用Abbe 物镜的分辨率,在上述研究基础上，到19世纪末，光学显微镜得到了更新，出现了金相显微镜，双目显微镜等,*数值孔径(NA) 数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言

2、）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下： NA=nsin(u/2)。 它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。,第一章 光学显微镜,第一节 引 言,20世纪初，等焦面显微镜出现,2次世界大战前，Zernike原理，相衬显微镜出现,1953年诺贝尔物理学奖,1955年，Nomarski显微镜（微分干涉显微镜）,1975年，Hoffman调制衬度显微镜,第一章 光学显微镜,第二节 成像原理,光学显微镜示意图1,第一章 光学显

3、微镜,第二节 成像原理,光学显微镜示意图2,第一章 光学显微镜,第二节 成像原理,瑞利判椐：,（确定分辨率的判据）,第三节 聚光系统,第一章 光学显微镜,聚光系统收集显微镜光源发出的光，将它会聚成各个方向均匀的照明光束，照明样品。,调整聚光系统得到所需的照明光束强度和发射角对获得好的成像质量特别重要。,更换物镜时需重新调整聚光系统的光阑大小,第三节 聚光系统,第一章 光学显微镜,第四节 显微物镜,第一章 光学显微镜,第一种结构,对红光和蓝光校正轴向色差,校正绿光的球差,一块单镜和两个双胶合结构,最便宜的物镜！,第四节 显微物镜,第一章 光学显微镜,第二种结构,校正红光和蓝光的色差,校正两个波长

4、的球差,三组双胶合透镜，一个半月形透镜和一个单镜,较大NA，较好分辨率，较贵,第四节 显微物镜,第一章 光学显微镜,第三种结构,校正红光、绿光和蓝光的色差,校正两个波长的球差,一个三透镜组合，两个双胶合透镜，一个半月形透镜和一个单镜,大NA，好分辨率，贵,第四节 显微物镜,第一章 光学显微镜,上述三种透镜没有校正场曲，要矫正场曲，还需增加透镜数目。,第四节 显微物镜,第一章 光学显微镜,场曲（Curvature of field） 场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。 在一个平坦的影象平面上, 影

5、像的清晰度从中央向外发生变化,聚焦形成弧型, 就叫场曲. 原因是中心离镜头近,周边离镜头远, 一般拍照团体人像,安排成弧型,就是纠正这一缺点.,第五节 目镜,第一章 光学显微镜,目镜进一步放大物镜产生的中间像,它也要矫正像差,目镜的示意图,第六节 焦深和景深,第一章 光学显微镜,在考虑分辨率时，通常考虑的是垂直于光轴 平面内点到点的分辨。,还有一个分辨率是轴向分辨率，也称作景深。,景深由物镜的NA决定，目镜只是放大被分辨物的细节,景深是显微镜物方会聚最近和最远位置间的距离*,*景 深 景深（depth of field）就是聚焦清晰的焦点前后“可接受的清晰区域”。这段距离的特点是实焦点后面清晰

6、的距离要长于前面清晰的距离，对于任意口径来说，其焦点之后的景深大约是焦点前面景深的2倍。清晰范围前后较短的，我们一般称之为景深浅（或景深短）；而清晰范围较大的，我们一般称之为景深深（或景深长）。,第六节 焦深和景深,第一章 光学显微镜,在显微镜中，景深是非常小，通常在微米量级,另一个参数是焦深：经常与景深相互混淆,焦深是指像平面内的最近与最远清晰成像的距离*,几何像面是指对非常薄样品的切片，即使没有像差，由于衍射效应，每个像点都会扩展到这个像面的上下。,*焦 深 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也

7、能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。,景深与焦深示意图,第六节 焦深和景深,第一章 光学显微镜,焦深随着NA和M(方法倍数)的变化而变化，在通常情况下，大NA有大的焦深，但景深很小。,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,明场显微镜 ：观测振幅（亮度）样品,主要分辨亮度和颜色（频率）,衬度=（B-S）/B）*100%,B 背景处强度 S 样品处强度,提高衬度简单方法：颜色+滤光片,*明场(Brigbtfield):观察试样直接反射光的方法.照明灯通过物镜垂直 导向而入射于试样.来自试样的直接反射光通过物镜即被观察到

8、.,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,暗场显微镜,*暗场(Darkfield):观察试样干涉方法.照明光线通过物镜外围斜射于式样,来自式样的干涉光即被观察到.适用于检测试样上微细的搽痕或裂痕,检测晶片等试样镜状表面,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,某暗场显微镜像， 有典型的干涉条纹,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,明场+暗场 结合明场和暗场， 可以在某些场合 进一步提高衬度,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,明暗场结合 图像事例,第七节 衬度增强机制 相衬显微镜*,第一章 光学显微镜,相位物体：只有相位变化，无强度变化，如生物细胞等。,如何将相位变化转变成强

9、度变化,人眼的特性：对强度和颜色变化敏感,相位板,环形光阑,* 相衬显微镜，又称相差显微镜： 相差显微镜（phasecontrast microscope）由PZernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差（位相差）变成振幅差（光强差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有

10、不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1.环形光阑（annulardiaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种： 1.A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2.B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。,第七节 衬度增强机制 相衬显微镜 图像,第一章 光学显微镜,第七

11、节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,偏光显微镜*（利用光的偏振性）,材料有各向同性与 各向异性之分，偏光 显微镜用于观测后者,应用：非等轴晶系的试样,结晶方位 磁光薄膜 铁磁材料,检偏器,起偏器,各向异性样品,* 偏光显微镜（polarizingmicroscope） 偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚。 （1）偏光显微镜的特点 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应

12、用。 （2）偏光显微镜的基本原理 偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台等。偏光显微镜的原理比较复杂，主要是利用光的偏振性提高衬度。先用起偏器将入射光转变为偏振光。偏振光照到样品后偏振状态发生变化，然后通过检偏器观测，可以观测到样品的细节。为了调整光的偏振性，中间还需用到相位片或相位补偿器等。,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,偏光显微镜图像,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,原理： 斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。 特点： 1. 提高未染色

13、标本的可见性和对比度 2. 图像显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕 3. 可检测双折射物质（岩石、水晶、骨头等） 4. 可检测玻璃、塑料等培养皿中的细胞和组织 5. 聚光镜的工作距离可以设计得更长 6. 可以用于明场，暗场和荧光观察。,Hoffman调制衬度显微镜,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,Hoffman调制衬度显微镜图像,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,利用光的干涉产生的干涉条纹，观察和测定表面起伏和倾斜的显微镜。特别适合于观察薄膜的厚度。,原理：光的干涉现象,干涉显微镜,第七节 衬度增强机制,第一章 光学显微镜,微分干涉衬度显微镜,原理: 微分干涉衬度显微镜是利

14、用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图像呈现出立体的三维感觉。不同折射率不同高度产生衬度,应用：台阶与表面,检偏器,起偏器,渥氏棱镜,渥氏棱镜,样品,第七节 衬度增强机制：微分干涉显微镜,第一章 光学显微镜,应用结果例子,第一章 光学显微镜,第七节 衬度增强机制：荧光显微镜,利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像，在生物医学方面应用较多。,第一章 光学显微镜,第七节 衬度增强机制：荧光显微镜,荧光染料,第一章 光学显微镜,总结,分辨率限制,衬度增强方法,光学成像原理,显微镜结构,显微镜使用：调节，粗调，细调,高放大倍数情况下要注意！,不同显微镜的主要应用： 1. 明场是显微镜观