分子生物学导论-分子生物学研究方法3

1、1,第九章 分子生物学研究方法(3),2,第七节核酸序列分析技术,一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 三、DNA序列测定的自动化 四、DNA杂交测序法 五、基因芯片测序 六、最新测序技术,4,原理：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。,不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,一、Sanger双脱氧链终止法,过程：制备ss-DNA与引物退火分为4个反应系统每个系统中加入dN

2、TP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸DNA聚合酶定序反应反应产物变性后电泳凝胶干燥放射自显影。 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。,ATGCGGTACCAT,5,3,测序模板,5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5,四套反应体系,1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP,TA,TACGCCA,TACGCCATGGTA,TAC,TACGC,TACGCC,TACG,TACGCCATG,TACGCCATGG,T,TACG

3、CCAT,TACGCCATGGT,2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP,3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP,4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP,7,双脱氧法的特点 需要单链模板、寡核苷酸引物和高质量的DNA聚合酶。,缺点： （1）聚合反应会因二级结构而提前终止，常常测不到准确的DNA序列； （2）由于经模板与引物结合后才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸DNA序列（例如对引物DNA的序列）不能测定； （3）该法直接分析的是合成的新链序列，而不是模板链，因此不能分析模板中甲基化部位； （4）需要适当的引物

4、和能合成单链模板的载体。,优点：简单、快速。,8,二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法,基本步骤: (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P)； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。,9,化学测序法的优点： （1）待测的DNA序列来自原有的DNA分子，因此可以分析DNA被修饰的碱基； （2）测序反应不受DNA二级结构的影响； （3）不需要将待测序的DNA亚克隆到其他载体上，不需要通过通用的引

5、物； （4）可测定较短的DNA序列。,化学测序法的缺点： （1）待测DNA需要进行末端放射性标记、变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析，操作较复杂； （2）该方法测序范围约为250bp，稍低于双脱氧法； （3）本方法主要限制因素是变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析分辨能力比较低。,10,三、DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备：可自动化 2）定序反应：可自动化 3）凝胶电泳：自动化有一定困难，制胶、点样、电泳、凝胶干燥、放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入：可自动化,DNA序列分析自动化包括两个方面的内容， 一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自

6、动化。,2. 自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黑色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）,12,优点: (1) 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； (2) 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； (3) 可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相

7、互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。,15,四、DNA杂交测序法,自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。,DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤： 首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交， 然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。,如果将一种核苷酸顺序

8、为5-AGCCTAGCTGAA-3的12-mer的靶DNA，与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。,当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。,上图是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片

9、段I可与18共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。,18,五、基因芯片测序,基因芯片测序流程,20,

10、六、最新测序技术,1. 新一代测序技术（Next generation sequencing technology） 美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪 美国Illumina公司 英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪 美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪 Dover/Harvard公司的Polonator测序仪 美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪 所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其称为“新一代测

11、序技术或者第二代测序技术”。,21,焦磷酸测序,边合成边测序,边连接边测序,3730 xl,Sanger双脱氧核苷酸,新一代测序技术的发展为基因组学研究带来了更大的机遇,23,几种新一代测序仪的比较,24,新一代测序技术的应用,25,2. 第三代测序技术（Third generation sequencing technology）,英国牛津纳米孔公司 基于纳米孔的单分子读取技术。 该技术在测序时DNA分子依靠核酸外切酶一次一个碱基地通过小孔，无需多次扩增和荧光标记。,26,第八节转基因技术,一、植物基因转化载体系统的构建 二、受体材料的选择 三、植物遗传转化体系 四、转化体的筛选和鉴定,蓝色

12、妖姬，转基因蓝玫瑰？,适宜外植体的选择及再生体系的建立,抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择,遗传转化操作,载体介导的 转化方法 DNA直接导入法 种质系统法,选择培养,转基因植株鉴定,获得再生植株,转化质粒的构建,转基因植株的繁殖与应用,利用报告基因 Southern 杂交 Northern 杂交 Western 杂交,植物遗传转化流程,30,1. 一元载体系统,一元载体系统是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体。,一、植物基因转化载体系统的构建,31,2. 双元载体系统,双元载体系统是指两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质

13、粒构成的双质粒系统，由于其T-DNA和Vir区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体。,一元载体(顺式载体),双元载体(反式载体),32,二、受体材料的选择,受体是指用于接受外源DNA的转化材料。 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1. 高效稳定的再生能力； 2. 受体材料要有较高的遗传稳定性； 3. 外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4. 对筛选剂敏感； 5. 转化率高。,33,常用的受体材料有以下几大类型:,1. 愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化(带有目的基因质粒的农杆菌侵染)，分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广

14、，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统,34,2. 直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。,35,3. 原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。,36,4. 胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体

15、数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。,37,5. 生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。,38,三、植物遗传转化体系,（一）载体型遗传转化系统,最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-induc

16、ing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。,39,农杆菌共培养侵染,诱导愈伤组织,分化生芽,生根,叶盘转化法,(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。,40,(2) 真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。该法简便、快速、可靠，不需要组织培养。 (3) 愈伤组织共培养 (4) 原生质体共培养,41,（二）DNA直接转化系统,1. 化学刺激法 细胞融合剂：

17、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）,转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。,优点：,42,将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。,2. 基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment),43,3. 高压电穿孔法,电击法,利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。

18、,44,4. 微注射法 细胞操作： 利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。 子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。,45,四、转化体的筛选和鉴定,1. 转化体的筛选 外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少 使用特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因： 抗生素抗性基因； 除草剂抗性基因 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体

19、上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。,46,2. 转化体的鉴定,（1）DNA水平的鉴定 （2）转录水平的鉴定 （3）翻译水平的鉴定,47,第九节RNAi技术,RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。,一、RNAi的发现,1995年，康乃尔大学的Guo等 秀丽新小杆线虫(C.elegans),二、RNA干扰的作用机制,49,基因敲除又叫基因打靶，通过

20、外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。,完全基因敲除 条件型基因敲除,第十节 基因敲除技术 (gene knock-out),51,第十节蛋白组学及其研究技术,一、蛋白质组学的研究内容 二、蛋白质组学的研究技术 1. 免疫组织化学技术 2. 双向电泳技术 3. 生物质谱技术 4. 酵母双杂交和噬菌体展示技术 5. 芯片技术 6. 凝胶阻滞电泳（EMSA） 7. DNase I 足迹法,52,mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome),蛋白

21、质组学(proteomics) 是1994年澳大利亚学者Wilkins 和Williams提出的。,蛋白组学(proteomics)旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式、结构、功能和相互作用等。,53,一、蛋白质组学的研究内容,1. 蛋白质鉴定 2. 翻译后修饰 3. 蛋白质功能确定 4. 医学应用,54,二、蛋白质组学的研究技术,蛋白质组学分为结构蛋白质组学和功能蛋白质组学两大类。 前者主要研究蛋白质氨基酸序列及三维结构、种类分析和数量确定；后者主要研究蛋白质的功能和相互作用。,（一）免疫组织化学技术,（二）双向电泳技术,57,（三）生物质谱技术,58,（四）酵母双杂交和噬菌体展示技术,（五）芯片技术,61,（六）凝胶阻滞电泳(Electrophoretic mobiliy shift assay EMSA),EMSA 是体外分析DN