免疫学实验-血清学反应课件

1、免疫学实验 一 血清学反应,微生物学与免疫学教研室,【基本要求】,1. 上实验课时，把个人的书包和衣物放在衣柜内，穿好白大衣。随身只带必要的实习指导、笔记本和文具。实验室内禁止饮食。 2. 用过的实验材料，放于指定地点，不得随意抛置。 3. 注意节约实验试剂，爱护实验器材。损坏器材时，应立即报告指导教师，听候处理。 4. 实验结束后，将实验台整理清洁，方可离开实验室。值日同学打扫好室内卫生并检查水、电、等开关是否关好，防止意外事故发生。,2,指抗原Ag与相应抗体Ab之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内，也可发生于体外。,3,一、抗原抗体反应的定义及用途,体内反应可介导杀菌、溶菌、调理、中和

2、毒素等作用免疫病理损伤超敏反应、免疫性疾病等,4,3D模型 IgG1,Ig：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的80%）和组织液中。,5,IgA,IgM,二、血清学反应的特点：,1、特异性：抗原抗体在体外的结合与在体内一样，也具有专一性，即特异性。,6,应用： 由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。,2、可逆性：抗原与抗体的结合是非共价键结合，在一定条件下又可解离为游离状态，反应具有可逆性。,7,静电引力 （electrostatic forces） 范德华引力:作用最小 （van der Waals interactions） 氢键:最具特异性

3、 （hydrogen bond ） 疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions）,3、可见性：反应体系中抗原抗体的比例适当，就能形成较大的抗原抗体复合物，在有一定量电解质或适宜pH等条件下，出现肉眼可见的凝集、沉淀等可见反应。,8,9,亲水胶体,疏水胶体,转化,NaCl,可见反应,血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。,当抗原与抗体结合使表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物成为疏水胶体,在电解质作用下，中和胶体粒子表面的电荷，使各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物,亲水胶体转化为疏水胶体,4

4、、阶段性：抗原抗体反应分两个阶段： 抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快，几秒或几分钟，不可见 可见阶段，短至数分、数小时，长至数日，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象,10,概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。,交叉反应（cross reactions）,抗原抗体交叉反应示意图,B,亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高,11,三、血清学反应的影响因素,12,1、反应物自身因素 *抗原：理化特性、Ag决定簇数量和种类。 *抗体：1、来源 2、特异性与亲和力 3、浓度 比例要合适,13,（1）电解质 作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层， 使AgAb

5、聚集。 常用：0.85%NaCl溶液、缓冲液、Ca2+、Mg2+等。 注意：盐析（salting）即电解质浓度过高 引起的非特异性蛋白质沉淀。,2、环境因素：,（2）酸碱度,Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的PI , pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应。 一般：pH68为宜，补体参与时pH7.27.4。 注意：自凝现象-即pH达到或接近颗粒性抗原的PI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。,（3）温度影响反应速度,一般：1540 为宜， 最适温度：37 过高（56）: Ag-Ab解离， Ag、Ab变性， 补体失活。 冷凝集实验：4 凝集，20解离。,（4）其他 适当的振荡、搅拌等

6、可加速反应,抗体的两个Fab段分别 结合两个Ag分子，相互 交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，（可见）。,Ab/Ag过剩 过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。,只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。,17,四、传统的血清学反应,1、凝集反应 2、沉淀反应 3、补体参与的溶血反应 4、中和试验,（一）凝集反应 1、定义： 颗粒性抗原（如细菌、红血球等） +抗体凝集现象。 颗粒性抗原与相应的抗体在体外结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集块，为凝集反应，反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,18,2、分类 （1）直接凝集反应 概念：天

7、然的凝集原与相应抗体直接结合呈现的细菌凝集或红细胞凝集现象称为直接凝集反应。 应用： 定性检测ABO血型鉴定、细菌鉴定 定量检测诊断伤寒病的肥达试验等,19,20,血型鉴定,（2）间接凝集反应（3）间接凝集抑制试验,21,（二）沉淀反应,1、概念：可溶性抗原+抗体沉淀现象。 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。,22,23,2、分类 （1）液相中的沉淀反应： 环状沉淀、絮状沉淀 （2）凝胶扩散： 单向扩散：,1%琼脂凝胶的孔径约85纳米，可允许各种Ag或Ab自由扩散，由近及远形

8、成浓度梯度。,24,通过标准品绘制标准曲线,不同病人抗原浓度测定,1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度,火箭免疫电泳,火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清学试验，是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。,25,电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度,26,可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相

9、遇并生成白色沉淀线.,双向扩散：,(1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。 (3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。,A1：待检抗原；A2：标准抗原,27,免疫电泳对流免疫电泳,28,在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白泳向负极；而一般抗原蛋白质泳向正极 抗原和抗体将在两孔之间相遇，,（三）中和反应：特异性抗体抑制多种抗原的生物学活性（细菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反应。 主要用于毒素的鉴

10、定、病毒感染性疾病的诊断以及病毒的鉴定。例如在临床实验诊断中测定风湿病患者体内的抗链球菌 O抗体的反应。,29,30,（四）补体溶血：红细胞与相应抗体结合，可激活补体使红细胞溶解，称为补体溶血反应或免疫溶血反应。 原理：补体激活的经典途径（补体的动画） 补体特点： 补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细胞（溶菌或溶血）。,31,溶血反应,RBC,+,RBC抗体 (溶血素),新鲜血清（补体）,溶血,由抗原抗体复合物结合C1q启动的途径 1. 激活剂 Ag-Ab复合物(IgG1,IgG2,IgG3,IgM) 2. 参与成分 C1C9 3. 激活过程

11、（三个阶段） 识别阶段 活化阶段 膜攻击阶段,35,五、现代免疫标记技术,免疫标记技术(Immuno-labelling technique)是指将抗原或抗体用荧光素、酶、放射性同位素和电子致密物质等加以标记，借以提高其灵敏度的一类新技术。 优点：特异性强、灵敏度高、应用范围广、反应速度快、容易观察、能定位、定量甚至定位。,1、酶免疫测定（Enzyme immunoassay,EIA),用酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原抗体反应。 用酶作标记物 由于酶的催化作用可使原来无色的底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色。,37,原理（以间接性ELISA为例）：,显色,2、放射免疫测定法（RIA）：,

12、38,3、免疫荧光技术,39,40,直接凝集试验,双向扩散试验,补体溶血试验,观看细胞免疫的示教片,实验内容,一、直接凝集试验试管法（1份/人） 试管法凝集试验是一种半定量的试验方法，是在试管内将抗原或抗体稀释不同倍数后加入等量的待检抗体或抗原，根据每管内的凝集程度，判定待检样品中相应抗原或抗体的有无及其效价。 试验中可能由于电解质浓度或pH 值不适宜等原因，而引起抗原非特异性凝集，出现假阳性反应，所以应设立阴性对照管。,41,教材P299,42,材料：1% 新鲜绵羊红细胞悬液、羊红细胞凝集素（兔抗绵羊红细胞免疫血清）等 方法：（理解对倍稀释法） 1. 取小试管7支，置于试管架上，编号。 2.

13、 用 1ml 刻度吸管吸生理盐水，第一管加0.9ml，其余管各加0.5ml。 3. 用 1ml 刻度吸管吸取兔抗羊红细胞血清0.1ml 加入第一管 中，反复吹吸三次，使之与盐水混匀，吸出0.5ml注入第二管。同样混匀后吸取0.5ml 注入第三管，依此类推。自第6管吸出0.5ml 弃掉。第八管不加血清作为对照。 此时自第一管至第七管血清的稀释倍数分别是1:10，1:20，1:401:320，具体稀释方法可参阅下图。,43,4. 各管加入绵羊红细胞悬液 0.5ml，于是各管血清稀释倍数又增加了一倍。 5. 将各管震荡均匀，放入37温箱中过夜，次日观察结果。,.,.,.,.,.,二、双向扩散试验检测

14、血清中的AFP（1份/2人） 【操作方法】 1. 双向琼脂扩散试验抗原抗体孔位置如下图所示 2. 用微量加样器孔中分别加抗甲胎蛋白诊断血清，周围孔 中分别加入待测血清和阳性对照血清，每孔加入25-30l。 3. 将琼脂板放入密闭的盒内（内放浸有5%石炭酸的纱布以保持湿度），置37温箱中，于24小时后观察结果。,44,注意：加样量力求准确，勿使样品外溢或在孔缘上残存小汽泡，以免影响扩散结果。 原则：满而不溢,44,待测1,AFP-Ag,AFP-Ab,待测2,定位标记孔,45,免疫学实验 二 续血清学反应,微生物学与免疫学教研室,一、分析上次结果,（一）血球凝集（直接凝集试管法）：观察结果并分析,

15、46,1、从温箱中轻轻取出试管架，不要摇动试管。先观察对照管（第7管），此管血球不出现凝集现象，红细胞在管底自然沉降呈现点状结构，上层液基本清澈透亮，管底可见红细胞沉积物，呈圆形，边缘整齐，轻轻振摇试管后，可见红细胞浮起又分散仍呈悬液。,2、试验管从第一管看起，管底有凝集块，边缘不整或卷起等现象，均为阳性反应，分别用（+）、（+）、（+）、（+）表示凝集程度。 （+）表示血球100% 凝集，红细胞形成片层凝集，均匀布满管底或边缘皱缩如花环状； （+）表示血球75% 凝集，红细胞形成片层凝集，面积略多于（+）； （+）表示血球50% 凝集，红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散； （+）表示血

16、球25%凝集，红细胞沉于管底，周围有散在的少量凝集。,47,3. 按下列标准判定，记录结果。 +：凝集特别显著，红细胞均匀地铺于管底，呈一薄层边缘有折迭状。 +：凝集显著，红细胞均匀地铺于管底呈一薄层，但周边红细胞凝集较疏松。 +：凝集清楚可见，红细胞平铺于管底呈一薄层，中央可明显见到一疏松的红点。 +：红细胞大部分沉集于管底成圆点状，周围有少量凝集的红细胞。 ：红细胞全部沉集于管底呈圆点状，四周液体清晰。 4. 判断效价：能见到明显凝集现象（+）的血清最高稀释度为该血清对1%绵羊红细胞的凝集效价（或滴度）。一般以出现 + 凝集反应的最高血清稀释倍数作为血清中所含凝集抗体的效价。,48,（二）

17、双向扩散（沉淀反应）：观察结果并分析 观察各孔之间有无白色沉淀线，根据他们的关系判断结果。 在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线（抗原抗体复合物）为阳性反应。若72 小时后仍未出现沉淀线则为阴性反应。试验时阳性对照与待测血清两者沉淀线发生吻合时，才能确定待测血清中含有甲胎蛋白。,49,三、实验内容,（一）补体溶血试验（1份/4人） 试剂：2% 绵羊红细胞、 溶血素（兔抗绵羊红细胞免疫血清）、 补体（新鲜豚鼠血清） 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡,50,51,实验步骤,混匀，37，30min,溶血素，即兔抗绵羊红细胞抗体，是以SRBC作为抗原免疫家兔所得的兔血清，一般实验前56、30mi

18、n灭活补体。 以溶血素最高稀释度能产生完全溶血者确定为一个单位，正式试验中一般使用两个单位溶血素。,52,53,结果,观看细胞免疫的示教片,54,55,用Hanks液配成1106 细胞/ml的淋巴细胞悬液。,提取外周血单个核细胞（PBMC）,T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）选择性刺激T细胞增殖； 脂多糖（LPS）、葡萄球菌A蛋白（SPA）可刺激B细胞增殖；,56,美洲商陆,58,成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于检测外周血T细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。,E花环原理,*,59,实验结果,淋巴细胞转化实验,DNA合成,分化,淋巴母细胞,刺激物,T淋巴细胞,未转化细胞,过渡态细胞,淋巴母细胞,60,此种转化能力可反映机体的细胞免疫功能，常被作为检测细胞免疫功能的指标之一。,结 果 观 察,转化细胞： 淋巴母细胞： 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状，核/细胞比例变小。 过渡型淋巴细胞：类似母细胞。 核丝分裂相细胞：核体呈现有