生物化学实验技术

1、,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,生物化学实验技术 Methods in Biochemistry,郝林琳 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Tel主要内容：技术理论 10学时第一章 生物化学样品制备技术 第二章 沉淀技术第三章 膜分离技术第四章 色谱技术第五章 分光光度技术 第六章 离心技术 第七章 电泳技术 第八章 印迹技术实验 50学时,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第一章 生物化学样品制备

2、技术,郝林琳 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Tel第一章 生物化学样品制备技术,概念 从生物 材料中获得某一组分的方法称为生物化学制备技术。它是生化工程、生化制药及生化分析的基础。 意义 生物分子制备是研究生物分子特别是生物大分子的前提 。,第一节生物化学样品制备特点,与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制

3、备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。,第一节生物化学样品制备特点,(5)为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的。 (6)生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一性”结论。,第二节 生化分离制备实验设计,生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 确定要制备的生物大分子的目的和要求：是进行科

4、研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。,分析方法,分析测定方法有两类：生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可

5、见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。,掌握生物分子的物理、化学性质,要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。,利用性质差异设计纯化方法,制备生物大分子的分离纯化方法多

6、种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： 利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。,第三节 生物大分子的提取,一、选择材料及预处理 二、细胞的破碎 三、抽提,一、选择材料及预处理 材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定

7、性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。,1.动物组织： 选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。 脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品得率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。,1.动物组织： 保存：对预处理好的材

8、料，若不立即进行实验，应冷冻保存。 a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：-10的冰箱内；长期保存：-70低温冰箱内。 b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后长期保存。 冰箱的除霜循环，可能对細胞造成伤害，要特別小心。解冻時要越快越好，但避免局部过热。,2.植物材料： 选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。 a.提取核DNA：选用黄化苗（生长710天小麦，水稻），防止叶绿体DNA

9、的干扰。 b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。 保存：冷冻采样后尽快放于-4-20冰箱内。 DNA,RNA 采样后，液氮速冻，至-70冰箱。对RNA样品，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。,3.微生物： 选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存 b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4保存数月。,二、细胞的破碎 1. 机械破碎： (1) 研

10、磨法 剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。此法较温和，适宜实验室使用。但加石英砂时，要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时，可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。,(2) 组织捣碎器法 用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时，须加入石英砂才有效。但是在捣碎期间必须保持低温，捣碎的时间不易太长，以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。 (3) 超声波法 借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多

11、用于微生物细胞的破碎，一般输出功率100-200W，破碎时间315min。如果在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。,(4) 压榨法 是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(细胞直径的孔)，致使其被挤破 、压碎。 (5) 冻融法 将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。,2.溶涨和自溶 溶涨：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子

12、大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。 应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将某些有效成分在自溶时分解。 3.化学处理 用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠) 处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。,4. 生物酶降解 生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来

13、的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。 而在破坏酵母菌的细胞时，可采用螺旋酶进行。一般对数期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于0.1mol/L柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)中，加入1%螺旋酶， 在30处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%巯基乙醇效果更好。,三、抽提 1.抽提的含义 抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成

14、分分离出来的过程。 经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。 一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。,2.抽提的影响因素 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因素，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。 （1）pH值 改变溶质解离状态。 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调

15、至一定pH值的有机溶剂抽提。 注意：当用酸，碱控制溶液pH值时，要边加边搅，防止局部出现过高的酸，碱浓度造成蛋白质变性。,(2)溶剂的极性和离子强度 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。 降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。,提高离子强度：在水溶液中加中

16、性盐（KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4） 一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。 高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。 常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。,(3)水解酶 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑

17、制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。 如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用68的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在1315抽提3h，可得到较高的回收率。因为68乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。 RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高，很容易使RNA降解，所以每一步都严格控制RNase，可采用DEPC（焦碳酸二乙脂）处理，带手套操作，提取液中加强的变性剂异硫氰酸胍等措施。,(4)温度 一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。 例如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG

18、，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8时， 从200公斤孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20时，从400公斤孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高温下制备的HCG粗品很难进一步纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破坏。,一般提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。 小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04,（5）搅拌 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。 （6）氧化 一般蛋白质都含

19、相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。,（7）金属离子 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。 （8）抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。如抽提液过多，则有利于

20、有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第二章 沉淀技术,郝林琳 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Tel概念 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 意义 沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 基本原理 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同

21、溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,第一节 蛋白质的沉淀分离,一、盐析 1.盐析的原理 定义 一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理 盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表

22、面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。,盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lg（S/S0 ）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；S0为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。,在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数S0。故上式可 改写为： lgS = lgS0 KsI = KsI =lgS0为一常数 值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关 ；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构

23、有关，Ks越大， 盐析效果越好。,所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,I可用下式计算： I = 1/2 miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。,2.盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的稳定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而受温度影响小(温度系数小)( 25时

24、溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。,09年全国硕士研究生入学考试农学联考生化题 酶纯化实验中,通常先用(NH4)2SO4作为分级沉淀剂,再用Sephadex G-25凝胶柱层析法从沉淀酶液中除去(NH4)2SO4。请问： (1)与其他中性盐沉淀剂相比，用(NH4)2SO4做沉淀剂有何优点？ (2)如

25、发现柱层析后酶的总活性较纯化前明显升高，可能的原因是什么？ (3)柱层析时，湿法装柱的注意事项主要有哪些？ 答:(1)硫酸铵具有溶解度大、温度系数小、对酶活力影响小和利于分离等优点。(2)纯化前酶液中可能含有酶抑制剂。(3)注意事项：层析柱应与水平面垂直；柱床体积至少是上样体积的3倍以上；层析介质中不能出现气泡和断层；柱床表面要平整，并保有一定的水位。,3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比来计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度

26、量。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： (1)加入饱和溶液法 (2)加入固体盐法,(1)加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。,(2)加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2） S2，S1:分别代表所需达到

27、的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。 实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25）,4.影响蛋白质盐析的因素 （1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在25-30g/L。 （2）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小

28、的离子盐析力强,（3）pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 （4）温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加； b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。 一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。,实际使用 制备初期：pH ，温度一定，改变盐浓度（离子强度）（Ks分段盐析）； 纯化，结晶：离子强度一定，改变pH，温度（分段盐析）,5.盐析时的注意事项 （1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使

29、其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀； （2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。 （3）选择好温度，一般在室温下进行； （4）蛋白浓度不易过高，一般2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。,二、等电点沉淀 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍

30、有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。,二、等电点沉淀 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。,三、有机溶剂沉淀法 作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； （2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。,三、有机溶剂沉淀法 优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。,缺点： 有机溶剂沉淀

31、法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。 中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。 由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。,有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,注意： （1) 低温操作 （2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。 （3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。 （4) 注意离子强度，离子

32、种类的影响。,四、选择性变性沉淀 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。 例如：利用加热，改变pH或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。,五、非离子多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。 沉淀机理 空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。 优点 （1）操作条件温和，不易引起变性； （2）具有极高的沉淀效率； （3）沉淀后多聚物容易除去。 应用 沉淀分离细菌，病毒蛋白；质粒纯

33、化（做洋葱表皮瞬时表达）。,第二节 核酸的提取与沉淀分离,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。 从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在 。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。DNP 在0.14mol/L的氯化钠溶液中， RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%； 当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。 所以常选用0.1

34、4mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。,DNP,1.DNP/RNP复合物的解聚： 主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。 去污剂 在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 有机溶剂 苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。 蛋白水解酶 本法较温和，常用的水解酶有蛋白酶K和蛋白酶E

35、，可以避免剪切和破坏核酸。,2.多糖的消除： 采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿12h，植物在取材前暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉类物质均会减少。 混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可达到分离目的。 或用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。,3.RNA的提取： tRNA(约占细胞内RNA的15%)的相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调节到pH5得到的沉淀的中可分离得到tRNA。 mRNA占细胞RNA的5%左右，很不稳定，

36、提取条件要严格控制。 rRNA约占细胞内RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。 RNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。,稀盐溶液提取 将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得RNA。 苯酚溶液提取 在细胞破碎制成匀浆后，用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，将RNA与蛋白质分开。,4.DNA的提取 从细胞中提取DNA，一般在细胞破碎后用浓盐法提取。即用1mol/L的氯化钠溶液

37、从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L NaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理 ，除去蛋白质，而得到DNA。,5. 核酸的沉淀分离 核酸分离纯化应维持在0-4的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。 常用的沉淀分离法有： (1)有机溶剂沉淀法 (2)等电点沉淀

38、法 (3)钙盐沉淀法 (4)选择性溶剂沉淀法,（1）有机溶剂沉淀法 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。 核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关，相对分子质量106Da的双链DNA可以丝状纤维缠绕在玻棒上；相对分子质量稍小的双链DNA或单链DNA、RNA则以凝胶形式存在，这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。,(2) 等电点沉淀法 脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点力pH2.0-2.5；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液调节到一定的pH，就可使

39、不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。,(3) 钙盐沉淀法 在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。,(4) 选择性溶剂沉淀法 选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。 在DNA与RNA的混合液中

40、，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第三章 膜分离技术,欧阳红生 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 Email: Tel概念 用人工合成的某种材料作为两相之间的不连续区间实现不同物质分离的技术叫膜分离。 基本原理 膜的作用是分隔两相界面，并以特定的形式限制和传递各种化学物质。它可以是均相的或非均相的，对称型的或非对称型的。中性的或荷电性的，固体的或液体的，其厚度可以从几微米到几毫米。 特点 膜分离操作简单、效率较高，没有相变，

41、节省能耗，特别适合处理热敏性物质。,第三章 膜分离技术,第一节 透析,透析(dialysis)借助半透膜相隔的两相液体,利用具有不同截留相对分子质量的半透膜,使高渗溶液中的小分子穿过半透膜进入低渗溶液一侧,生物大分子被载留在膜的高渗溶液一侧,从而将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术.如把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行透析，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。,第一节 透析,透析(dialysis) 原理 透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外

42、两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4透析，升高温度可加快透析速度。 透析的应用 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。,影响透析速度的因素： （1）半透膜的通透性：市面上有商品化的不同型号的透析膜，透析管；常用的半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火绵纸或称赛璐琔纸和其他改型的纤维素材料。但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。,影响透析速度的因素： （1）

43、半透膜的通透性： （2）透析外液的更换：反复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行初期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。 （3）温度：温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。 （4）压力：增加压力可加快透析速度，如真空透析。,透析袋的使用： 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即

44、可使用。实验证明，50乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。 使用后的透析袋洗净后可存于4蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。 新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。,透析袋的使用： 含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。 透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。 检查透析效果的方法是：用

45、1 BaCl2检查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 检查NaCl、KCl等。,超滤(Ultrafiltration):利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过一定孔径的特制薄膜渗透到膜外,大分子被阻止在膜内,从而使大小不同的分子达到分离的目的。超滤是脱盐、浓缩、生物大分子的分级分离常用的方法。,第二节 超滤,超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其它分离方法有效率更高、更灵活的优点。,第二节 超滤,原理 在外力作用下，超

46、滤膜对大分子物质的截留主要是筛分作用，决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。 现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用，有加压、抽滤和离心等多种形式。滤膜也有多种规格，他们截留相对分子质量不同的蛋白质。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，被截留物质的Mr变小。,分类 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。 微孔过滤所用的操作压通常小于4104Pa，膜的平均孔径为500埃14微米（1微米104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。

47、超滤所用操作压为4104Pa7105Pa，膜的平均孔径为10100埃，用于分离大分子溶质。 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35105Pa140105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。,超滤膜 超滤技术的关键是膜。 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 114都是稳定的，且能在90下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用12年。 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2h)）；截留率（以百分率表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。,超滤装置 超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。,超滤的主要应用： 浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。,梯度分离：按分子大小梯度分