5放射自显影影像

1、放射自显影,Autoradiography，ARG,李晓愚 讲师,本章重点： 放射自显影的定义 放射自显影的基本类型和基本方法 放射自显影的感光材料,一 概述,1、定义： 放射自显影:利用射线使感光材料感光形成潜影，经显影定影后形成图像；判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量）的技术。,2、放射自显影的发展,1867年:铀盐可以使银离子感光； 1924年 Lacassagne 应用于研究钚在生物标本中的分布 1946年，Belanger和Leblond首次建立现代放射自显影的方法。,3、放射自显影的优点,1）灵敏度高。 2）定位准确，能把定位和定量结合分析 3）感光材料具有累积成像的效应，所

2、需的放射性物质可极微量。 4）操作简单易行，不需要复杂昂贵的设备。 5）形态、机能和代谢的综合分析 6）结果可以长期保存,局限性： 1、实验周期长。 2、定量不准确，只能半定量。,4、应用举例,药物、营养物质、毒物等在器官、组织、细胞中的分布、运转 研究特异性标记前体的参入部位、特点、影响因素 标记抗体或药物在离体标本上进行抗原研究或受体的定位示踪,二 放射自显影的原理,（一）潜影形成的原理： 和普通光学摄影原理相同； 利用射线使感光材料感光在标本中放射性存在的原位置出现银颗粒的沉积。,1、电离：释放电子 感光乳胶中每颗溴化银结晶由许多AgBr分子组成。 制造乳胶时，都使晶体发生点阵上的缺陷敏

3、化中心。,具有缺陷的晶格排列,完整的晶格排列,当核射线作用于溴化银结晶时，使某些分子电离射出电子，向敏化中心移动形成阴电层。 AgBr+-Ag+Br+e-,2、Ag+离子向敏化中心移动： Ag+离子向敏化中心移动，与电子结合，即射出的电子被带正电荷的银离子俘获，形成银原子。 Ag+e+-Ag,3、形成潜影 许多带正电荷的银离子被显影剂还原成银原子，在该溴化银结晶颗粒中形成潜影。,（二）潜影的消退： 已经还原的银原子在水、氧的作用下重新变成离子，使已经形成的潜影消退。 放射自显影的曝光过程应在干燥、低温或充氮气的环境下进行。,（三）显影和定影,显影液将银离子还原成银颗粒的过程 显影液=显影剂+促

4、进剂+保护剂+抑制剂 显影剂：还原作用，米吐尔、海德尔 促进剂：提供碱性环境，增加显影作用，常用碳酸钠 保护剂：中和还原产物，亚硫酸钠 抑制剂：抑制未形成潜影的银盐分解，溴化钾,定影：定影液溶解未形成潜影的银晶体。 定影液=定影剂+保护剂+停显剂+坚膜剂 定影剂：溶解银晶体，海波 保护剂：抑制定影剂被酸分解，亚硫酸钠 停显剂：终止显影液的继续作用，醋酸 坚膜剂：防止乳胶膨胀、脱落、擦伤。钾矾,三 放射自显影的材料,（一）感光材料： 1、组成 由银盐和明胶组成。 银盐多为卤化银，如溴化银。 明胶主要起支持作用；吸水膨胀后具有通透性,2、分类： （1）原子核乳胶： 溴化银和明胶按照一定的比例混匀制

5、备而成； 常温下呈粘稠液状，低温下则为胶冻状，温度升至40左右时为液态。 可以根据使用需要制备成各种形态,液体核乳胶：由溴化银和明胶按照80：20的比例混合制备，可制备成不同形状和厚度。 核乳胶干板：核乳胶胶片 揭膜核乳胶：,中国原子能科学研究院物理生产的核乳胶,（2）氚片： 由溴化银、碘化银和明胶组成。 银晶体颗粒平均直径为1m 单面涂胶 主要用于3H标记化合物的自显影,（3）X线片： 由溴化银、碘化银和明胶组成。 银晶体颗粒平均直径为2.5m 双面或单面涂胶 主要用于射线能量较高的宏观自显影,（4）自显影增强剂： 在感光材料里面加入荧光材料或将荧光材料制作成薄膜覆盖在凝胶表面。 感光材料在

6、射线和光子的双重作用下面感光，可以缩短实验周期。,暗盒和增强屏,（5）磷屏成像： 用可重复使用的磷屏作为成像板 专门的读出装置。,计算机磷屏成像系统,优点： 可用于多种核素的宏观自显影 操作简便 不需胶片和显影定影等照相处理步骤 磷屏可以重复使用 缺点： 分辨率较低 目前还不能用于高倍光镜和电镜自显影 仪器价格比较昂贵,（二）放射自显影中常用的放射性核素,应考虑其射线的种类、能量和半衰期。 3H 、14C 、35S 、45Ca 、32P、33P、131I、125I 、99mTc等。 发射射线的核素毒性都较大，一般不用于示踪研究。 单纯的发射 射线的放射性核素，难于在乳胶中形成潜影，自显影效果差

7、。,放射自显影常用的放射性核素,四 放射自显影的基本技术和方法,（一）主要类型： 宏观自显影：整体水平 光镜自显影：细胞水平 电镜自显影：亚细胞水平,1、宏观自显影： 常用肉眼、放大镜或低倍显微镜观察 用灰度或黑度对比来判断示踪剂的部位和数量 优点是可以同时观察各脏器、组织中放射性示踪剂的分布，多用于小动物的整体标本，大动物的脏器或肢体，以及各种电泳谱、色谱和免疫沉淀板等的示踪研究。,小鼠头部的宏观自显影,凝胶电泳的自显影结果,核酸电泳展开板的放射自显影,2、光镜自显影： 以光学显微镜为工具进行观察，以镜下的银颗粒分布及数量来判断放射性核素示踪剂的部位和数量。 镜下的银颗粒为黑色或深棕色的小圆

8、点 适用于冰冻组织切片、石蜡组织切片，血细胞涂片、骨髓细胞涂片等标本的示踪研究。,放射自显影检测寄生虫感染中的脾细胞,3、电镜自显影： 以电子显微镜观察，以电镜下银颗粒的分布及数量来判断。 电镜下电子轨迹为蛇样扭曲 适用于细胞超微结构上的精确定位和定量,蛇毒素与 乙酰胆碱 受体结合,（二）基本方法,1、基本步骤： 示踪：向实验动物体内或离体标本上引入放射性核素标记物。 标本制备：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片 自显影制备：暗室中在制备的标本上敷加感光材料。 曝射：避光条件下核射线作用于感光乳胶。 照相处理：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。 阅读分析。,2、示踪剂引入的方法 体内

9、实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔注射或直接脑内注射和灌胃等途径给入放射性标记化合物。 体外实验：可在培养瓶中给入、或将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，洗去多余的示踪剂后再进行自显影实验。,3、标本制备： 组织切片： 冰冻切片： 石蜡切片：,整体动物切片： 专用整体动物切片机上制成,牙齿、骨骼：制备磨片 体液、细胞：制备涂片 电镜标本：超薄切片机 其它：电泳条、层析条等可干燥后使用,4、自显影片的制备方法： 液体乳胶浸膜法： 在暗室中将液体核乳胶置37 40水浴融化，玻棒搅拌15min至均匀。将载玻片带标本的插入乳胶内，浸沾乳胶，约0.5min后缓慢匀速地垂直提出。干燥过夜。在有干燥剂的暗盒内

10、，密封置4曝射。然后显影、定影、染色、封固等则在自显影结束后进行。,接触法： 将样品摆放在合适的载波片上，取与载波片大小相同的核乳胶干板覆盖在载波片上，用橡皮筋固定，外面包上黑纸，然后4度密封保存充分曝光。 注意：接触松紧要适当以免引起挤压效应,接触法示意图,湿贴法： 暗室中将冰冻切片直接贴在干板的乳胶面，冷冻干燥后曝射。,揭膜法： 将核乳胶制备成核乳胶揭膜，悬浮于液体中。用固定好样品的载波片在液体中捞取揭膜，使揭膜覆盖在样品上。,金属环法：电镜自显影 在暗室内融化乳胶，按说明书要求稀释，降温至25，用不锈钢制成的金属环（直径4毫米）插入乳胶液中，轻轻垂直提取，金属环上即形成单层乳胶膜。将环套

11、在载有超薄切片的铺有火棉胶的铜网上，单层乳胶膜即覆盖在切片表面。曝射后显影定影，干燥后即可在电镜下观察。,5、曝射 放射自显影的曝光时间与所使用的放射性核素种类有关。 125I需要感光48小时以上。 14C要数天几周。 3H要10天以上，12个月。,6、显像处理： 显影：18-20，2-4min 定影：18-20，8-15min 水洗：清除残余显影、定影剂，20min以上 7、干燥、染色和封固： 干燥箱干燥 常规苏木素-伊红染色 盖玻片封固,五、放射自显影的影响因素,（一）放射自显影的分辩力 指2个相邻的放射性核素分子在标本中仍能显示为2个颗粒的最短距离。,分辩力的影响因素 1、乳胶中银颗粒的大小和密度：颗粒越小，密度约高，分辩力越高 2、乳胶厚度：越厚，分辩力越低 3、样品厚度：样品越厚，分辩力越低 4、样品与乳胶间的间隙：间隙越大，分辩力越低,5、曝射时间：时间延长，分辩力下降。 6、核素能量：能量越高、分辩力下降 7、显影时间：越长，分辩力下降,（二）放射