现代分离技术-6.ppt

1、协同萃取体系 假设两种萃取剂单独使用时的萃取分配比为D1和D2， D1+D2=D加加，则有协同效应时的分配比D协同D加加； 无协同效应时，D协同D加加； 当D协同D加加时，则称为反协同萃取效应。,影响溶剂萃取的因素,（1）萃取剂浓度的影响 （2）酸度的影响 （3）金属离子浓度的影响 （4）盐析剂的影响 （5）温度 （6）萃取剂和稀释剂的影响 （7）第三相的影响,TBP萃取铀的分配系数一般是随着稀释剂介电常数的增大而下降，,但是对于冠醚萃取体系来说，情况正好相反， 随着稀释剂介电常数的升高，分配系数也增高， 可能是冠醚萃合物在介电常数较小的非极性溶剂中的溶解度太小的关系。,（7）第三相的影响,在

2、某些萃取体系中会出现第三相，即两层有机相和一层水相。 第三相的形成影响萃取过程的分相和损失被萃取物，必须避免其形成。,生成第三相的原因,1.萃取剂在有机相中的溶解度太小 2.萃合物在有机相中的溶解度太小 3.另一种萃合物生成 4.界面污染 提高萃取温度有利于增加不同相之间的互溶性，有助于消除第三相,3.2胶团萃取胶团萃取（micellar extraction）,胶团萃取（micellar extration） 是被萃取物以胶团或者胶体形式从水相被萃取到有机相的溶剂萃取方法。 它既可用于无机物的萃取，也可用于有机物的萃取。 在无机物的方面：金属或其无机盐可以形成疏水胶体粒子粒子进入有机相。 被

3、萃取物主要限于金、银、硫酸钡等，溶剂主要限于氯仿、四氯化碳和乙醚等。,胶团是双亲（即亲水又亲油）物质在水或有机溶剂中自发形成的聚集体。,什么是胶团？,当向水溶液中加入表面活性剂达到一定浓度时就会形成表面活性剂聚集体，即胶团。,胶团是怎么形成的哪？,什么是表面活性剂？,表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。 表面活性剂的分类： 阴离子表面活性剂； 阳离子表面活性剂； 非离子型表面活性剂。,在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸2乙基己基磺酸钠，结构式见图,常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见下表,

4、临界胶束浓度（critical micelle concentration）：表面活性剂在溶液中开始形成胶团时的浓度称为 ，简称CMC。 当溶液中表面活性剂浓度低于CMC时， 它主要以单体(monomer)形式，即分子或离子形式存在。 表面活性剂形成胶团后，溶液的许多物理化学性质，如表面张力、摩尔电导率、渗透压、密度、增溶性能等，在一个很窄的浓度范围内呈现不连续变化。,表面活性剂是一类典型的双亲物质，在水或有机溶剂中达到一定浓度就会形成胶团（或称胶束）。,3.2.1胶团的分类,胶团可以分为正向微胶团和反向微胶团。 当向水溶液中加入表面活性剂达到一定浓度时（CMC），会形成表面活性剂聚集体，即胶

5、团。 胶团大小通常在纳米级,在这种胶团中，表面活性剂的极性头（亲水基）朝外（水），而非极性尾朝内，这种胶团称为正向胶团，或简称正胶团。 与此相反，当向非极性溶剂中加入表面活性剂达到一定浓度时，会形成憎水非极性尾朝外（向溶剂），而极性头朝内，这种胶团称为反向胶团，或简称反胶团（reversed micelle）。,反微团： 表面活性剂的极 性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核” (po1ar core),有机溶剂,极性“头”,极性的“核”,非极性“尾”,此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”(water pool)。,蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图中

6、。,由于周围水层和极性基团的保护， 保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。,A水壳模型；B插入模型 C吸附模型；D溶解模型,反胶团的溶解模型,（1）静电作用（2）空间位阻效应,3.2.3影响反胶束萃取的主要因素,1） 水相pH值对萃取的影响,蛋白质是一种两性物质，具有确定的等电点(pI) 等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等， 净电荷为O，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(isoelectric point,简写pI)。 当溶液的pH值小于等电点时，蛋白质的表面荷正电，反之则荷负电。,AOT是阴离子型表面活性剂，故形成的微胶团的内表面荷负电。 如水溶液的pH小

7、于pI，则蛋白质的正电荷与微胶团的内表面相吸形成稳定的含蛋白质的微胶团。 反之如pH大于PI，蛋白质在微胶团的溶解度将很低或不溶。 但如pH过低。蛋白质会变性，溶解度也下降。,pH对蛋白质溶解度的影响,AOT体系中，三种低分子量的在较低pH时，几乎能完全溶解于反胶团相。 不过，pH过低时，蛋白质变性，溶解度随之降低。 显然，对于多种蛋白自混合物的分离，只要他们的pI有差异，就可以通过控制溶液的pH使他们达到分离。,2）表面活性剂种类的影响,应从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂。 目前研究中常用的AOT反胶束体系和

8、其他体系有许多不足：如不能用于分子量较大的蛋白质的萃取和往往在两相界面上形成不溶性的膜状物等等。 为克服这些不足，可通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。,3）离子强度,水相盐浓度（离子强度）决定了带电荷的反胶团的内表面以及带电荷的蛋白质分子表面被静电屏蔽的程度。 离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来 因此，低的离子强度有利于蛋白质的萃取，高的离子强度有利于蛋白质的反萃取。,3.2.4反胶团萃取在生物样品分离中的应用,3.2.4反胶团萃取在生物样品分离中的应用,图3

9、23表示核糖核酸酶、溶菌酶和细胞色素C 蛋白质混合溶液约分离过程。 在pH9时核糖核酸酶不溶而其他两种酶可溶，故在pH9，KCl0.1mol/L时核糖核酸酶只留在水相中而溶菌酶和细胞色素C则完全溶于反相微胶团中。 再将含有溶菌酶和细胞色素C有机相与0.5mol/LKCl的水相接触细胞色素C转入水相。 最后将含有溶茵酶的有机相与含有2.0mol/LKCl.pH11.5的水溶液混合，就可将溶菌酶转入到水相中，这样就达到了三种蛋白质分离约目的。,3.3双水相萃取 (Aqueous Two Phase Extraction),1 举例 左图所示的两个粘稠的液层， 下层含有大部分葡聚糖 上层含有大部分甲

10、基纤维素。 两层的主要成分都是水。,双水相萃取与前面所介绍的水有机溶剂萃取原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。 研究表明，在双水相体系确定时，被分离物在较大的浓度范围内KD为常数，这有利于分离研究工作的准确性和易于实施。 只是萃取体系的性质不同，两相都占了8595%的水分，生物活性物质如蛋白质、核酸在这种环境中的分离不易失活。 不存在有机溶剂残留的问题，低相对分子量的高聚物无毒，不挥发，对人体无害。,2 双水相的形成,在双水相体系中，之所以一种聚合物富集于某一相，而另一种聚合物富集于另一相，这是由于两种聚合物的不相容性所至。 这种聚合物的不相容性上要是由于聚合物分子的空间阻碍作用。 相

11、互间无法渗透，不能形成单一的水相，故具有强烈的相分离倾向。,双水相体系：将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是。 形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。 一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。,无论是天然的还是合成的亲水性聚合物，当它们与第二种聚合物相混时，只要聚合物浓度达到一定值以上，就可能产生相分离的现象。 如浓度低于此值，则只有均一的单相。 此外，某些聚合物的

12、溶液在与某些无机盐的溶液相混时，只要浓度达到一定值，也会产生两相。这就是聚合物-盐双水相体系。,3 、 常用的双水相体系 高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 和PEG/ Dextran 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。,3.3.2双水相体系的影响因素,1）聚合物浓度的影响 聚合物浓度增加，使分相容易，使两相的相对组成的差异更大，因而要影响到被萃取物的分配系数。 2）聚合物组成的影响 相对分子质量对聚合物组成的影响取决于聚合物的化学性质。,3）盐类 盐的正负离子在两相的分配系数不同，从而在两相

13、间形成电位差，影响带电的分离物在双水相的分配。 同时还发现，当盐类浓度增加到一定程度时，影响减弱。 盐浓度超过15mol/L时，由于盐析作用，蛋白质易于分配于上相，分配系数几乎随着盐的浓度成指数增加，且不同的蛋白质增大程度各异。利用此性质可使蛋白质相互分离。,下图为聚合物体系（7%葡聚糖-500+4.4%PEG-6000）中盐的种类和浓度对蛋白质分配系数KD的影响。,4）pH影响 体系的pH值对被萃物的分配有很大影响，这是由于体系的pH变化能明显地改变两相的电位差，而且，pH的改变还导致蛋白质带电性质的变化。 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变

14、化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行,5）温度 分配系数对温度的变化不敏感 聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且室温时粘度较冷却时(4 ) 低,有助于相的分离并节省了能源开支。 6）低分子量化合物 低分子量化合物的存在对双水相的形成有一定影响， 如蔗糖和氯化钠，但是一般在比较高的浓度下才会对两相的形成起作用。 7）双水相体系的性质也有一定的影响。,3.3.3 双水相萃取技术的特点 (1) 系统含水量多达75 %90 % ,两相界面张力极低(107104 Nm - 1) ,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递 (2

15、) 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般只有515min。 (3) 双水相分配技术易于连续化操作。,(4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物有较高的收率。 (5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去12 个分离步骤,使整个分离过程更经济。 (6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。,3.3.4、双水相萃取的工艺流程 双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。,3.3.5 双水相的应用举例 分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从- 淀粉酶发酵液中分离提取 - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ，pH = 8 ，- 淀粉酶收率为90 % ，分配系数为19.