DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解.pptVIP

1、一、PCR实验背景 二、PCR基本原理 三、PCR引物设计原则 四、 PCR反应注意事项 五、常见问题与对策 六、 PCR的应用,讲解内容,第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接,一实验背景,The polymerase chain reaction (PCR) is invented by K. Mullis in 1985. This technique is used to amplify a specific sequence of DNA in vitro by simulating the replication procedure of natural DNA in vivo.

2、 PCR enable us to unlimitedly amplify DNA fragments.,The Nobel Prize in Chemistry 1993,体外扩增特异DNA片段,二PCR基本原理,在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下， 特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,模板（DNA或cDNA） 2 l 10PCR buffer（含MgCl2） 5 l dNTPs (10mmol/L) 1 l 5引物 (10mol/L) 1 l 3引物 (10mol/L) 1 l 去离子水（补足反应体系） 39 l Taq DNA pol. (2U

3、/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）,50l,在一微量离心管中依次加入下列试剂：,加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。,PCR仪设定的反应条件： 94oC 45 S DNA变性 55 oC 45 S DNA复性 72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min,一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：,介绍：PCR仪,如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；,如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。,PCR仪内发生的反应,变性,退火,延伸,5,5,PCR

4、的基本原理,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PC

5、R反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR产物的积累规律,反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率等因素。,pre-denaturation 95 for 5min;,Denaturation: 95 for 3060s,30 cycles,反应分三步： 变性（denaturation）； 退火（annealing）； 延伸（extension）

6、,PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。 PCR反应中有两条引物，即5引物和3引物。,三、PCR引物的设计,引物设计 的 基本原则,引物的设计实例 (),PCR 引物设计 的 基本原则,2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。,1.引物的方向永远是 53 引物长度一般在1530核苷酸之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp。 过短会使PCR的特异性降低；过长没有必

7、要。,引物3端要避开密码子的第3位。 因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。,3.引物3端是DNA延伸的起点，因此一定要严格与模板DNA配对。尤其是引物3末端连续8个碱基要求与模板严格互补。 但引物的3端最好没有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。 引物3端最好选择T？ 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。 引物3端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。,4. 碱基要随机分布。 引物中四种碱基的分

8、布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。,5.引物GC含量在45-55% (40%60%)之间，Tm值最好接近72。 上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。 引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580。Tm值最好接近72。 退火温度：一般低于Tm值210。,引物长度要确保Tm值不低于54C。,6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物内部不应存在互补序列。 以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤

9、其在引物3末端。按经验，不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3末端一般不达到 3 bp。 引物间不应存在互补序列。 尤其应避免3端的互补，以免形成引物二聚体。,引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）,Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin. The 3 end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the targ

10、et DNA.,5-GTTGACTTGATA T 3-GAACTCT,Primers That Form Dimers Primer pairs should be checked for complementarity at the 3-end. This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer. Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.,5-ACCGGTAGC

11、CACGAATTCGT-3 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5,7.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 引物5 端修饰包括：加酶切位点； 引入点突变、插入突变、缺失突变序列； 加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。 引入启动子序列等。 标记生物素、荧光、地高辛等； 引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。,在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。,

12、8. 引物5端和中间G值应该相对较高，而3端G值较低。 G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析）,9. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。,引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,10. 引

13、物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。,值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。,引物设计,1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条 氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的 重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。 2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是53方向，正

14、向（Sense）引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引物则与这股模板DNA序列相互补。 4、 引物的酶切位点：通常在引物的5-端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。,specificity: conserved genomic region. 75% homologous with other region

15、. Specially, 8 bases at 3end. (2) specific sequence length: 15/1830 base. (3)G+C contents45-55%. ATCG random distributed (4) Avoid hairpin in each primer, specially at 3end. (5) Avoid complement between primers (4bp以上）, specially at 3end. (6) unique restriction enzyme sites can only be added to the

16、5 end of the primers. (7) T is the best candidate at 3 end ？,小结: 引物设计时应遵循的原则 () General rules for Primer design,引物的设计实例 (),已知IFN- cDNA序列, 你该如何设计引物？,at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcg

17、gata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc

18、 aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa,at gaaatataca agt,gaagagca tcccagtaa,at gaaatataca agt,3,5,3,5,上游(5 )引物的结合,CTTCTCGTAGGGTCATT,下游(3 )引物的结合,设计引物时: 5引物与位于待扩增片段5上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成; 3引物与扩增片段3端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是

19、这一对引物之间的DNA片段。,答：5引物照抄，3引物互补倒读； 酶切位点加在引物的5； 调GC含量的碱机放在最前边； 此外无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。,at gaaatataca agt,gaagagca tcccagtaa,atg aaatataca agt,3,5,3,5,上游(5 )引物的结合,CTTCTCGTAGGGTCATT,下游(3 )引物的结合,- : For G+C content,Sense primer:,5GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT3,15 bp,GC=11 AT=15,Anti-Sense primer:,5ATCGGAATT

20、C TTA CTGGGATGCTCTTC3,17 bp,BamHI start codon,GC=12 AT=15,EcoRI stop codon,引物的方向是53：,特异性序列是否少了点?,通常在引物的5-端设计适当的限制性酶切位点,引物设计软件介绍： Primer Premier 5.0 顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单 Oligo 6.57 引物分析著名软件，主

21、要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。 Primer DSigner 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。,四 PCR反应注意事项,Optimization of PCR condition ,PCR方法操作简便， 但影响因素颇多。,去离子水（补足反应体系） 39 l 模板 2 l 10PCR buffer（含MgCl2） 5 l dNTPs (10mmol/L) 1 l 5引物 (sense 10mol/L) 0.51 l 3引物 (anti-sense 10mol/L) 0

22、.51 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）,（一）、PCR反应体系 - final volume 50l,加各种成分 最好 在冰上进行。,1. 模板 DNA 不是越多越好 ： 2 l,1)在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高， 2)但模板浓度过高会导致引物无法与模板结合，反应的非特异性增加。 3)一般采用102105拷贝的待扩增片段作为模板: 微克水平的基因组DNA、重组质粒DNA用ng水平的量。 4)模板过多还能大量消耗镁离子。,The amount of template“more is less”.,Dont add too m

23、uch template,Template DNA 不能含有其提取时所用试剂： 提取genomic DNA 的基本过程： （1）裂解细胞，消化蛋白质，抑制DNase activity proteinase KSDSEDTA （2）然后用酚氯仿多次抽提，去除蛋白质 （3）用RNase去除RNA （4）用乙醇沉淀DNA，air dry, 无菌水溶解。,2. 引物 ： 0.5 l,Primer 1: OD=5,PCR 反应引物浓度为0.10.5mol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。 如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。 但引物浓度太高， （1）会增大引

24、物结合到不严格配对区域的机会，这样的错配会导致非特异性产物的扩增; （2）可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。 但如果该比例太低，PCR效率也会降低。,primers,引物的配制,Primer 1: OD=5,注意： 冻干品，计算一管引物的总含量或克分子数 先配成100mM的浓度作为储存液 工作液: 10mol/L, - 20保存。 50 l反应体系中加：0.51 l, 终浓度：0.10.5 mol/L,如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。,切记： 不要将合成回来的引物一次性配成工作液！,primers,RT的引物选择：,Oligo (dT)15-18,Sp

25、ecific anti-sense primer,Random primer,因为基因序列与mRNA序列是一致的。,病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？,正链RNA病毒：RT引物用anti-sense primer； 负链RNA病毒：RT引物用sense primer。,Thermostable DNA polymerase,3. DNA聚合酶,活 性： 5-3方向的聚合酶活性。 在7580具有最高的聚合酶活性。 半衰期：95 ，40分钟 缺乏3-5外切酶活性。 因此没有校正功能。 Fidelity（保真度）：PCR反应的错配率一般为12X

26、10-4 An extra A,（3.1）Taq DNA聚合酶 (2U/l) 1l,保存: 在-20至少6个月。 抑制剂: 乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS等。 内源DNA污染: 制备过程中残留的原细菌DNA等。 会在无模板对照管出现扩增带。,在 50l 反应体系中加 Taq : 一般为 0.52U， Too Low Conc.: low activity， PCR产物的量减少 Too High Conc.: non-specific amplification.,加各种成分 最好 在冰上进行。,操作时先加水，最后加酶,（3.2）Pfu DNA聚合酶,此酶耐热性极好，在97.5 半衰期3

27、小时， 具有35外切酶活性， 催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。,35 proofreading exonuclease activity. with greater accuracy. no extra A.,（3.3）Vent-TM DNA聚合酶,半衰期：100 ，95分钟 97.5 ， 130分钟 其扩增产物的长度可达1013kb。 活 性：具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000。 忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。,（3.4）Tth DNA聚合酶,半衰期：95 0C，20分钟 活 性： 具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。 但不具35外

28、切酶活性，没有校对功能， 催化聚合反应的错误掺入率为1/500。,缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。,4、 10 X PCR buffer 5 l,Buffer: 10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8, 20)。,5、Mg 2+： 2025mmol/L 3l,For Taq polymerase activity. 镁离子浓度：1.52.0 mmol/L,Concentration: too Low: low activity too High: non-specific amplification,Taq D

29、NA聚合酶活性需要Mg2+。 Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。 Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。,当反应体系中含有高浓度的 primers、dNTP、EDTA 时: 上述分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+ 浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 Vary Mg2+ in steps of 0.5 mM Within 1.55.0 mM; Sometimes a compromise between yield and specificity.,dNTPs 贮备液：浓度为 10 mmol/L。（注： dNTP 具有较强的酸性，使用时应用1mol/LNaOH将

30、pH值调至中性(7.07.5)。分装，20存放，反复冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L。 dNTP浓度过高会增加非特异性配对碱机的错误掺入率。 低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，减少PCR产物量，但可提高反应的特异性及实验的精确性。 4种 dNTP 浓度应相同: 错误碱基的掺入率降至最低。,1kb gene : 1 l; 2kb gene : 2 l,6、底物: dNTPs（脱氧核苷三磷酸） (10mmol/L ) 1 l （被稀释了 50 倍, 即浓度：200 mol/L）,7、 添加剂： DMSO（二甲基亚砜） 2.5 l,相当于将退火温度提高

31、了5。 但10的DMSO会对聚合酶活性产生不良影响。,加入适量二甲基亚砜（终浓度： 5）有利于引物、模板的解链，减少其二级结构，,1）为什么有时候需要进行热启动？,（二）、如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？,热启动： Taq DNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中， 这样可保证模板DNA、引物变性充分，避免发夹结构或其它二级结构影响引物的退火，使引物能更加顺利地、特异性地结合到模板上。,热启动结束后暂停PCR反应， 在PCR仪上直接趁热加入DNA pol。,Optimizing the PCR Reaction program,变性温度： 一般选用94 95 。

32、变性时间： 可根据模板长短、G和C含量确定， 一般采用30秒。,2）变性,但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 Half life of Taq DNA polymerase： 92.5oC 2h， 95oC 40mins， 97oC 5mins.,30 cycles will need 15 min,3）退火温度和时间,PCR的基本流程： 94oC, 45 sec 55oC, 1 min 72oC, 2 min,退火温度的变化是根据引物的GC比例、引物的长度调整的。,Annealing,From 45oC to 60oC. Usually it is around 55 for 1 min.

33、,退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。 引物长度一般在15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T),(a) Annealing temperature is too high,Primers and templates remain dissociated.,(b) Annealing temperature is too low.,Mismatched hybrid.,(c) Correct annealing temperature.,Priming occures only at the desired target sites.,How to

34、decide annealing temperature?,(a) (b) (c),温度越高，特异性 (specificity)越高。,温度：72，74，是 Taq 酶的最适工作温度。,时间：根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间。 过长会导致产物非特异性增加。 酶的 延伸效率： 1000bp/1min。 小于500bp，一般采用1分钟即可； 5002000bp: 2 min。 超过2000bp，一般可适当延长延伸时间，3分钟。,4）延伸温度和时间,典型的PCR条件： 9495 30S，55 1min，72 2min 2530个cycles后 72 延伸10min。,循环次数： 2530cycl

35、es 循环过多会增加碱基的错配几率。,4）循环次数,总结： 其他因素,1）热启动：提高扩增的特异性 2）添加剂：DMSO消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进DNA复性时的特异配对。 3）液体石蜡：防止反应液蒸发后反应成分的改变。,How big is a target DNA? typically in the size range 100-1500 bp. Longer targets are amplifiable 25 kb. Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times.,五、 常见问题与对策,PCR常见问题之一,无扩增产物-假阴性,1. 模板: 提取的模板核酸中含有杂蛋白质、 酚、EDTA等抑制了Taq酶活性 too much or too little,原因,2.引物： 选一个好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 两引物带的亮度应大体一致，如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。