《重组DNA技术精简》PPT课件.ppt

1、基因重组与基因工程 Gene recombination and genetic engineering 孙庆涛 刘华明 2011.3.16,重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆（molecular cloning）。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： 载体和目的基因的分离 载体和目的基因的切断 载体和目的基因的重组 重组DNA的转化和扩增 重组DNA的筛选和鉴定,一、载体和目的基因的分离,为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。 （一）载体： 基因工程中常用的载体(vector)主要包括 质粒(plasm

2、id) 噬菌体(phage) 病毒(virus) 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,1质粒：,存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。,2噬菌体： 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置

3、换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。,3病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。,（二）目的基因： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。,2人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,3.从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补D

4、NA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。,4从基因文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G-文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。,5利用PCR合成： 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因

5、碱基序列的改变。,PCR概述,PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成 酶和四种脱氧核糖核酸进行DNA的体外合成反应。 PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。,PCR基本原理,DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、DNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成

6、份参与的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中必需成分是 1. 模板DNA 2. DNA聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。,变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用Taq DNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低510，PCR实验要对退火温度进行优化。,PCR基本步骤,延伸

7、：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的3端，使引物沿53方向生成与模版DNA互补的新DNA链。,1、目的基因的克隆 2、基因的体外突变 3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列测定 5、基因突变分析,PCR的主要用途,二、载体和目的基因的切断,通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(

8、cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。,三、载体和目的基因的重组,即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 （一）粘性末端连接法： 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在

9、末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。,（三）人工接头连接法： 将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。,四、重组DNA导入受体细胞 （一）转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（05

10、）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。,(二)感染（infection） 噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。,(三)转染（transfection） 转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 常用的方法有电穿孔法（electroporation）、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法等。

11、进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。,五、重组DNA的筛选和鉴定,由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行： （一）根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,插入灭活法筛选重组体,（二）根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。,（三）根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。,