试验5：柱色谱分离实验

1、柱 色 谱,了 解： 1. 柱色谱法分离有机物的原理。 2固定相和流动相的选择原则。 掌 握： 1. 色谱柱的填充方法。 2柱色谱分离的基本操作。,一、实 验 目 的,柱色谱分离示意图,二、实 验 原 理,二、实 验 原 理,吸附剂的性质：均匀、表面积大、不反应、吸附能力不同,化合物的结构：化合物的吸附性和它们的极性成正比,洗脱剂的极性：溶解度适中、不反应、易获取回收,影响分离效果主要因素,3. 试样成分的性质 在给定的条件下，各个成分的分离情况，与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下列顺序增加： Cl，B

2、r，I C=C -OCH3 -CO2R C=O ，CHO -SH- -NH2 -OH -CO2H,溶解试样用的溶剂，极性应与流动相接近,装置图,装柱,洗脱,主要试剂及其物理常数,偶氮苯,苏丹,300目 硅胶,石油醚、乙酸乙酯,乙酸乙酯,吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。,干法装柱 湿法装柱,装 柱,三、实 验 内 容,五、实验操作步骤,1、装柱：湿法装柱，在烧杯中，称取6g 300目的硅胶粉末， 再向烧杯中加入约35mL的石油醚，用玻璃棒搅拌是混合均匀。,2、混合液的加入：将色谱柱固定好，色谱柱下放置一锥形瓶。 将石油醚硅胶混合液摇匀，趁硅胶未沉淀，通过漏斗

3、迅速将混 合液倒入色谱柱中，注意混合液不要倒满溢出。装住过程中要 不断的敲打柱子，使硅胶沉淀均匀、密实。,五、实验操作步骤,3、加样：待溶剂石油醚至硅胶层相平时，用滴管吸取分离混 合物，向色谱柱中滴加5-8滴，至混合物完全渗入到硅胶中。 (混合物为：苏丹三、偶氮苯的苯溶液，注：不能用极性大的 溶剂溶解混合物，否则柱色谱不能分离。 4. 洗脱：用滴管吸取纯的石油醚沿管壁加入到色谱柱中，注 意滴加过程沿色谱柱壁加入，防止硅胶层溅起。继续加入 石油醚，当黄色组分被洗脱至与红色组分完全分离后可用洗脱 液（石油醚：乙酸乙酯=9:1）洗脱，直至所有物质都被洗脱完全。 4、产品收集：分别收集不同颜色的产物及

4、洗脱剂，并量取 和记录各自的体积。,六、注意,1、吸附剂的选择和活化 2、洗脱剂的选择：对未知样品先用极性小的溶剂洗 脱，再用极性大的溶剂洗脱 3、装柱的技术：松紧度 4、吸附剂的用量：是被分离样品量的30-40倍,有时 需增加至100倍 5、柱高：柱子太高洗脱慢,样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面。,加 样,三、实 验 内 容,洗 脱,在柱顶不断加入洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干，使流动相流速适当。,三、实 验 内 容,试样有色，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。,

5、收 集,试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，分离效果越好。,三、实 验 内 容,三、实 验 内 容,玻砂防堵塞 装柱需紧密 加压不可大 溶剂勿流干,四、注 意 事 项,色谱法在有机化学中的应用: 分离混合物 精制提纯化合物 利用比移值(Rf)鉴定化合物 跟踪反应进程,小 结,色谱法的特点: 分离效率高 复杂混合物,同系物,异构体等。 灵敏度高 可以检测出g g-1(10-6)级甚至ng g-1(10-9) 级的物质量。 分析速度快 几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。,小 结,柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝,

6、实验原理,甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:,甲基橙,亚甲基蓝,由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实验以硅胶为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。,三、实 验 内 容,干法：10g 硅胶 +乙醇,先用乙醇 后用水 操作,组分颜色,组分颜色,1mL样品 加样操作 0.5mL2乙醇洗涤,柱色谱操作：,实 验 步 骤:,仪器和试剂,1.仪器

7、锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱 2.试剂 柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲 基橙、亚甲基蓝。 H2O95%乙醇=11(A液) 0.2molL-1HCl95%乙醇=11(B液),实验步骤,装柱： 1、装色谱柱： （1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂 直固定在铁架台上。 (2) 关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水（也是洗脱剂，至柱体积的 1/2） （3）填吸附剂：称取10g硅胶于小烧杯中,加入15mL蒸馏水,用玻 璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱, 使其逐渐沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，打开活塞，用小锥型 瓶承接, 控制滴速为1 滴秒,装完后在上面加一层脱脂棉（ ，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。,实验步骤（续）,加样：当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞，加入5mL左右的A液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用量筒准确加入0.50mL以A液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400gL-1)。 洗脱：待此混合液将要渗入柱内时,立即用A液洗脱,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂