FACSCanto流式细胞仪原理.ppt

1、FACSCanto流式细胞仪原理及应用,陈清彬Qingbin_ ,BD公司介绍,BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州,BD公司介绍,位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材,BD公司流式细胞仪产品,FACS Vantage SE-大型分选机,FACS Aria-高速分选的台式机,FACS Diva-高速分选的数字化大型机,BD公司流式细胞仪产品,FACSCount流式细胞仪,FACSCalibur流

2、式细胞仪,FACSCanto II流式细胞仪,BD 公司流式细胞仪产品,BD FACSCanto II流式细胞仪,FACSCanto II流式细胞仪原理,流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标?,细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC） 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC） 相关的荧光强度,散射光信号的特征,FSC和SSC 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。 488nm激光激发产生散射光,前向角散射光信号FSC,侧向角散射光信号SSC,散射光信号的特征,红细胞裂解

3、的全血,荧光信号的特征,什么是荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。,荧光信号的特征,发射光的荧光强度与结合的位点成正比,信号产生,荧光信号,荧光信号的特征,常见荧光染料的发射波长,直方图显示荧光信号,点图显示荧光信号,什么是流式细胞仪？,在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器；,流式细胞仪特点及检测标本,特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂

4、解液,FACSCanto II流式细胞仪系统组成,流式细胞仪 液流车 工作站,FACSCanto简介,配置空冷激光 两根激光:488nm、633nm、 光路固定，无需调校 液流系统 信号检测系统 八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号 电子系统将电信号转换成数字化信号,液流系统,流动室 鞘液 工作液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。 样本流 单细胞悬液，浓度51051 106/mL,液流系统,鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。 检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。 在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激

5、光激发后，样本中的颗粒被检测。,液流系统 -FLOW CELL(流动室),液流系统,液流系统-样本流速,样本流速的选择,高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。,光学系统,光学系统,染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号被收集、过滤然后被检测器转换成电信号。,信号采集系统,激光 488nm，633nm， 激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号 信号检测组件-八角形和三角形 光学滤片 将激光

6、激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMT PMT-将光信号转换成电信号,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 深红 APC 633 670 免疫荧光 红色 PI 488 620 DNA染色 橙红 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红,常用荧光染料(488nm,633nm激发),Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素 Phycoer

7、ythrin (PE) 藻红素 Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白 Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白 Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures),FACSCanto信号检测组件,种类 八角形 三角形 构成 检测器 滤片,FACSCanto信号检测组件,八角形检测组件,FACSCanto信号检测组件,三角形检测组件,FACSCanto信号检测组件,检测器 鞘液流中的颗粒

8、通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。 FACSCanto 两类检测器 光电二极管：FSC 光电倍增管PMT：SSC和荧光信号,FACSCanto信号检测组件,光学滤片用于调整光谱的分布。 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。,FACSCanto的滤片,长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光,FACSCanto的滤片,带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。,FACSCanto的滤片,FACSCanto的滤片,FACSCanto电子系统,将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化 有三类电脉冲信号 高

9、度信号H 面积信号A 宽度信号W,几个概念,信号放大 PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。,几个概念,颜色补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。,颜色补偿,FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器,几个概念,颜色补偿 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。,几个概念,颜色补偿 通常干扰

10、光占该染料所发出荧光总量的X%,补偿模型图,颜色补偿判断标准,未作颜色补偿,颜色补偿判断标准,补偿后,怎样进行颜色补偿,Comp Beads 用于流式细胞仪多色分析时调整荧光补偿。含两种微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白链的微球，可与小鼠/大鼠免疫球蛋白的链结合；及阴性对照微球，不与免疫球蛋白结合。这两种微球与鼠源性的荧光抗体混合时，显示为清晰的阳性群与阴性群（背景荧光），可据此手动调整颜色补偿。 Anti-Mouse Ig补偿微球组合，产品号：552843 Anti-Rat Ig补偿微球组合，产品号：552844 Anti-Rat/hamsterIg补偿微球组合，产品号：552845,仪器运作需要

11、的质控品,仪器校准需要微球 BD FACS 7-Color Setup Beads（Cat No.335775） 补偿调整需要微球 BD CompBeads Anti-Mouse Ig, (Cat No.552843) BD CompBeads Anti-Rat Ig, (Cat No.552844) 仪器清洁 BD FACSRinse 漂白水,流式细胞仪的应用,流式细胞仪可以告诉我们什么？,细胞内和细胞外发生了什么事件？,流式细胞术的应用,细胞生理学研究 细胞膜表面标记 胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 分选 CBA,细胞生理学研究,细胞相对大小和颗粒性 胞内pH值检测 Ca+流动性检测 膜

12、电势检测 细胞活性检测 细胞活力(增殖能力)的检测,细胞生理学研究,细胞相对大小和颗粒性分析,细胞生理学研究,胞内pH值的检测,细胞生理学研究,Ca2+流动性检测 Ca2+ 是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 最常用的染料 Indo-1 excited at UV Fluo-3 excited at 488nm Fura red excited at 488nm,细胞生理学研究,Ca2+流动性检测,细胞生理学研究,细胞膜电位的改变 超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强

13、度减少。 染料和试剂 DiOC6(3) DiOC5(3) DiOC1(3) DiOC1(5) Valinomycin Gramicidin D CCCP,细胞生理学研究,细胞膜电位的改变,细胞生理学研究,细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光,细胞生理学研究,细胞活力分析 CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl ester) 是一种亲脂性染料，可被细胞膜吸收。细胞标记CFSE后再诱导增殖，分裂后的细胞将含半量的CFSE，如此可监控细胞分裂的数目。,细胞生理学研究,细胞活力分析 上

14、图中人T细胞被标记并刺激后，可跟踪六代的分裂。如果配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。,细胞膜表面标记,CD2,CD4,细胞内标记,胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase. 胞内细胞因子 磷酸化蛋白,细胞内标记,胞内细胞因子,细胞内标记,磷酸化蛋白 接受刺激后细胞的动态反应 刺激因子对特异位点的作用 检测转录后调控 特殊蛋白在正常及异常细胞的表达,细胞内标记,磷酸化蛋白,Relative Cell Number,Alexa Fluor 488,Control IFN-g stimulated (1000u/ml),细胞周期分析,DNA含