实验三+微生物的分离和纯化(张理珉).ppt

1、实验三 微生物的分离和纯化,目的要求,1、掌握一定的无菌操作技术（包括上次实验中培养基及实验用具的灭菌），了解无菌（洁净）空间的实现手段和方式。 2、掌握倒平板、制斜面的技术和方法。 3、掌握几种分离纯化微生物的原理及基本操作技术和方法。,实 验 内 容 一无菌操作技术知识介绍,一、无菌操作技术的概念,指防止微生物进入机体或其他物品的操作技术，具有两方面的要求。 防感染针对生物体（包括操作者）。 防污染针对培养物、实验所用物品和实验室空间等。 针对人来说，还要解决防止双向交叉感染操作的问题人对培养物等的污染；培养物对人的感染。 实验室中如何实现？,二、污染来源,空气（空间）实验室、车间、生产场

2、所等； 实验用器材实验用具、器皿、器械、试剂、药品等； 实验材料实验用材料和样品本身携带； 人体衣服、毛发、皮肤表面、和外界相通的腔道等,三、无菌操作技术建立的理论依据和过程,路易斯巴斯德（Louis Pasteur, 1822-1895 ）,曲颈瓶实验 否认“自然发生学说” 建立“种胚学说”,曲颈瓶试验过程,约瑟夫李斯特（Joseph Lister 18271912）,发明和推广外科防腐技术的外科专家 。 认真仔细洗手； 使用的手术器材和敷料做彻底的卫生处理（高温消毒）； 向手术室空中喷洒石炭酸 （空气消毒）； 病人的伤口要消毒，要包扎绷带； 医生要穿洁白的衣服。 使用手术后死亡率由45 减

3、少至 15 （1889年）。,十九世纪外科手术的场景,四、现今无菌操作技术的介绍,世界各国洁净度等级对照表,生物安全实验室分级,中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准,五、设备及设施介绍,具有高效过滤器（HEPA） 过滤器级别： HEPA过滤器（标准） ；ULPA过滤器 达到的洁净等级 HEPA：ISO 5级（美联邦209E标准100级）； ULPA：ISO 4级（美联邦209E标准10级） 过滤效率 HEPA：99.999%（0.3 m ）；ULPA：99.9999%（0.12m）,水平流和垂直流超净工作台,WD-9409型 桌面式洁净工作台,生物安全柜,生物安全柜的要求（A2）,针对垂直

4、下降型层流风向方式； 气幕隔离式设计，防止内外交叉污染，提供对产品及操作者、环境的双重保护功能； 有专门的空气处理系统（无害化处理外排）。,生物安全柜和生物安全实验室,风淋门,洁净手术室,吹淋 洁净传递窗,洁净病房,六、无菌操作规范（11步）,1. 打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒半小时以上。 2. 进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。 3. 穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。 4. 风淋2分钟。 5. 0.1%过氧乙酸水（新洁尔灭）泡手，擦干。 6. 点燃酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。,7. 打开各类瓶盖

5、前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。 8. 垂直式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。 9. 同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系或微生物菌种；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。 10. 漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。 11. 操作完毕后恢复工作台面，并进行必要消毒灭菌。,七、中华人民共和国国家标准洁净厂房设计规范,总体设计（洁净厂房位置选择和总平面布置、工艺布置和设计综合协调、噪声控制、振动控制） 建筑（人员净化和物料净化设施 、防火和疏散 、室内装

6、修 、装配式洁净室等） 空气净化（洁净室正压控制、气流组组织和送风量、空气净化处理、采暖通风、风管和附件） 给排水 工业气体管道 ,制药企业洁净车间过道、车间内部和设备,八、无菌操作技术的介绍及演示（实验室）,操作要点： 利用酒精灯或煤气灯的火焰外焰的外部高温区造成的无菌小环境来进行操作；形成上升气流，防止灰尘沉降污染；加热固定器皿口处的灰尘和微生物颗粒。 还可以利用一些辅助仪器设备进行操作（超净工作台，一般为100级）； 无菌操作只是相对而言的，只要有人活动的地方就很难达到绝对无菌。 操作规范、准确、迅速,实 验 内 容 二平板和斜面的制备,一、培养基融化，倒平板和制备斜面,1、牛肉膏蛋白胨

7、培养基： 冷却至60左右，倒平板。 2、马丁氏培养基： 冷却至60左右，加入链霉素至终浓度30g/ml，混匀后倒平板。 3、高氏1号培养基： 冷却至60左右，加入3%K2Cr2O7 0.7ml / 500ml，混匀后倒平板。,每组倒1317个平板（根据各班次组数具体安排）； 装若干支斜面试管（灭菌后摆放斜面），每种培养基统一制作（牛肉膏100支、马丁氏45支、高氏1号45支）。 和其它组交换8个平板（自已组没有的2种培养基平板，各4个），用于稀释涂布平板法操作（共计12个）； 平板划线分离法操作用牛肉膏蛋白胨培养基平板进行（2个，练习用）； 斜面下次实验使用。,二、平板的制备（操作要快）演示,

8、1、使灭菌的固体培养基冷却至60左右（容器外表面热而不烫），防止倒平板时过多冷凝水的产生； 2、准备好若干灭好菌的培养皿，拆去包装，堆放整齐备用； 3、一只手拿好装有培养基的三角瓶，除去瓶口的包装放好（内部不能向上），瓶口倾斜放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤）。 4、另一只手取1个灭菌的培养皿，抬平，放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤），打开培养皿盖（不可全开） ； 5、将培养基倒入已打开的培养皿内，使之刚好流平（1520ml），放置于水平的桌面上待凝固后即可（凝固过程请勿再动培养皿，否则会造成平板培养基表面不水平）。,将上述平板放入28恒温培养箱中倒置空白培养24小时以上，以检查灭菌是否彻底。

9、 同时还可以去除培养基表面多余的冷凝水水膜（24小时左右）。,三、平板及斜面无菌检查,以下为本次实验要完成的任务,四、制备平板的数量 根据实验组确定,牛肉膏蛋白胨培养基平板 （6个实验组准备组+2个）=X个/组； 高氏1号培养基平板 （4个实验组准备组+2个）=Y个/组； 马丁氏培养基平板 （4个实验组准备组+2个）=Z个/组。,五、平板上的标注要求（一般要求在培养皿底部标注）,注意 所有标注都可以用缩写或简写，目的只有一个，自已可以分清即可； 标注的内容是根据自己的实验所决定的，没有完全的模式。,六、斜面的制备,将固体培养基中加入的琼脂通过加热（90以上）完全溶解； 利用分装器将溶化的固体培

10、养基加入到15150mm试管中（最常用，也可根据实际情况选用其它规格），加入量为试管高度的1/41/5； 加塞、包扎、标记、灭菌； 摆放、冷却、无菌检查； 流程图： 称量融化调pH 值过滤分装加塞包扎灭菌搁置斜面无菌检查使用或备用,七、斜面制备的数量,1、牛肉膏蛋白胨培养基斜面 100支/全班； 2、高氏1号培养基斜面 45支/全班； 3、马丁氏培养基斜面 45支/全班。,实 验 内 容 三微生物的分离和纯化,一、基本概念,菌落单个细胞（孢子）或少数几个同种细胞（孢子）在固体培养基上，经过适当培养后，形成肉眼可见的具有一定形态特征的细胞群体。 菌苔若干菌落（同种或不同种）聚集在一起，不可分，无

11、一定形状形态特征。 稀释倍数溶液经过定量稀释后可以计算的倍数，一般用于CFU/ml计算。 稀释度稀释倍数的倒数，标记和表述时用。,分离指为了生产和科学研究的需要从自然混杂状态得到纯种的过程（可能达不到细胞纯）； 纯化同一个菌落不一定是同种菌，需要对其进行纯化，使之达到细胞纯； 多数情况下，二者无明显划分，是统一在一起的过程。,发明培养基，并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立； 证实炭疽病因 炭疽杆菌； 发现结核病原菌结核杆菌； 科赫法则（4点）,罗伯特科赫 （Robert Koch， 1843-1910）,二、实验原理,分离的目的： 得到单细胞 得到单细胞的手段： 利用显微单细胞挑取器操作（

12、仪器特殊，针对微生物效率不高）； 稀释取样单位体积由多至少单位面积由多至少（单菌落分散好）。 操作流程图： 稀释单细胞培养形成菌落挑取单菌落多次重复达到纯化的目的,单细胞挑取法 简易单细胞挑取法 micromani pulator,三、实验方法和步骤,1、稀释涂布平板法 2、稀释混合平板法 3、平板划线分离法,1、稀释涂布平板法,倒平板倒置空白培养24小时（?） 制备土壤稀释液涂布倒置培养挑取单菌落。 不经特殊处理，只适用于好氧菌的培养。,2、稀释混合平板法,取已灭菌的空白培养皿加入分离样品稀释液（一般为1ml） 倒入冷却至4550灭菌固体培养基旋转混合均匀（操作速度要快？） 凝固后适温培养；

13、 挑取单菌落较困难（破坏培养基），菌落形态不易观察（飞碟形），一般用于计数（分布均匀，相对误差较小？）和厌氧菌的分离培养。,3、平板划线分离法,利用接种环在固体琼脂培养基上划线，使粘在接种环上的微生物分布在所划线上而得到稀释（由点变线，线由点组成），达到分离的目的。 操作简单，但不能进行定量测定；一般不用于分离的最初步骤，而多用于微生物菌种的后序纯化步骤。,稀释度和每皿中微生物个数关系示意图,厌氧培养的一些设备和方法,平板涂布培养分离法和平板混菌培养分离法,四、几种常用的微生物分离纯化方法比较,以下为本次实验要完成的任务,五、稀释涂布平板法（本次实验用）,土壤悬液的制备及稀释，样品稀释液的加入

14、（0.1或0.2ml/皿），涂布平板（3种培养基平板） 稀释操作要点：一般采用10倍稀释法进行；每个稀释度的样品液必须充分振荡混匀；每1支所用到的无菌吸管只能接触一个稀释度，否则将造成较大的误差； 涂布操作要点：涂布时，不在涂布器上过多加力（利用涂布器的自身重力，手只需带动其运动就可以了），以免划破培养基；以画同心圆方式涂布完成；涂布完成后正面放置30分钟以上再倒置放入温箱中培养。,1、稀释涂布平板法完成的工作内容,1、牛肉膏蛋白胨培养基平板： 涂布10-4、10-5 各2皿 2、高氏1号培养基平板： 涂布10-3、10-4 各2皿 3、马丁氏培养基平板： 涂布10-2、10-3 各2皿,2、

15、土壤悬液的制备,称取10g土壤（1g）加入到90ml（99ml）无菌水中放入摇瓶机中（100rpm）振摇20分钟取出后静止5分钟左右（使土壤颗粒沉降，以免阻塞吸管）吸取上层较清的液体制备相应的土壤稀释液 注意： 此操作不仅只适合于土壤悬液的制备，样品的来源可以是其它固体样品（食品、药品等）； 根据样品的实际情况，可以采用不同的用量，自行设计。,3、从土壤分离微生物操作过程,安全吸（移）液器,微量移液器,倒平板（已介绍） 制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90ml无菌水的、具有玻珠的250ml三角瓶中，充分振摇20min，使微生物分散（10-1 ）。 用一支1ml的无菌吸管取1ml的土壤悬液

16、放入到一支盛9ml无菌水的大试管中，充分摇匀，然后用一支1ml的无菌吸管从此管中吸取1ml土壤悬液放入到另一支盛9ml无菌水的大试管中，混合摇匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液（根据实际掌握稀释度）。,加样、涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-2、10-3 、 10-4和10-5四种稀释度（根据实际选择稀释度），然后用无菌吸管分别由10-2、10-3 、 10-4和10-5四管土壤稀释液中各取0.1ml或0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌不锈钢涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀（以同心圆形式涂布），室温下静置30min左

17、右，使菌液吸附于培养基上。,培养 将高氏号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28培养箱中培养3-5天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37培养箱中培养2-3天（如时间不好安排可以在室温下进行培养，一周后也就是下次课来进行下面的实验）。,因培养皿的需要量和占用较多，学生实验难以满足以下要求； 所以在以后科研、工作中，做稀释分离和平板菌落计数时，至少要做3个稀释度，每个稀释度至少重复3个培养皿。,注意：,六、平板划线分离练习（2个平板）及操作要点演示操作,无菌操作； 一般采用高浓度菌液，或直接挑取菌落或菌苔； 接种环（平整）和培养基接触的夹角越小越好； 操作时动作要轻柔自然，不要过多的在接种环上加力； 划完一组线后，接种环上的残留物要通过灼烧灭菌再进行下一组划线。,常见划线分离操作示意图,划线分离实际操作及效果,七、实验完成后用具的清洗,1、不锈钢刮子的清洗 用自来水冲洗干净，交到讲台上的塑料筐里。 2、1ml吸管的清洗 取出塞入的棉花，用自来水冲洗干净；交到讲台上的塑料筐里。 3、18180ml大试管的清洗 用试管刷蘸洗衣粉水刷洗试管内外（除去记号笔的标记），自来水漂洗干净，交到讲台上的塑料筐里。 4、回收90ml无菌水瓶中的玻璃珠（倒入指定位置），清洗干净三角