《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用

1、常用分子生物学技术的 原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology,一、分子杂交与印迹技术 二、PCR技术 三、基因文库 四、生物芯片技术 五、生物大分子相互作用研究技术,第一节,分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique,（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同来源的DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或R

2、NA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,一、分子杂交与印迹技术的原理,用可检测的放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的待测的核苷酸片段结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,（二）探针技术,核酸分子杂交现探针技术的应用： 研究DNA分子中某一种基因的位置。 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。 是基因芯片等技术的基础 。,（三）印迹技术,利用各种物理方法（毛细作用）使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化

3、分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 将载有DNA单链分子的NC膜放在杂交反应液中，溶液中具有互补序列的DNA单链分子就可以与NC膜上的DNA单链分子互补结合而得以检测。,二、印迹技术的类别及应用,（一） Southern blotting (DNA印迹 ),（二） Northern blotting (RNA印迹 ),（三） Western blotting (蛋白质印迹 ),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,洗膜,Southern 印迹杂交流程：,组织或细胞,基

4、因组DNA,限制酶酶解及电泳分离,转移到硝酸纤维膜或尼龙膜,标记的探针,预杂交,杂交,放射自显影,总DNA,目标DNA,用限制酶消化,不同大小的DNA片断,根据片段大小 用凝胶电泳分离,滤膜转印、变性,同标记的DNA探针孵育、鉴定,预杂交： 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。 预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜

5、上所有非特异性吸附位点。,三种印迹技术的比较,放射自显影照片,其他： （1）斑点印迹 (dot blotting) 不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于杂交分析。 （2）原位杂交 (in situ hybridization) 样品不经提取而直接用组织切片或细胞涂片用于杂交分析。（3）DNA芯片技术 (DNA chip)。,第二节,PCR技术的原理与应用 The Principle and Application of PCR Technology,PCR：Polymerase Chain Reaction 1983,聚合酶链反应，一种DNA片段（基因）的体外扩增术,以待扩增的DNA片段为

6、模板，以一对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，依半保留复制机制沿模板链延伸直至完成2条新链的合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得以扩增。,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 含Mg2+缓冲液,PCR体系基本组成成分,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技术的工作原理,PCR技术原理示意图,PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,引物： 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5端引物和3端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。

7、 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。,引物设计遵循下列原则： 引物长度一般为1530个碱基。引物过短，扩增的特异 性降低；引物过长，虽提高扩增的特异性，但敏感性下降。 引物中碱基的发布是随机的尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 GC的含量在引物的碱基中一般为4555。 引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 两引物间不应存在有互补序列，尤其是避免3端的互补。 引物的碱基序列不应与非扩增序列有同源性。 引物的3端碱基一定要与模板互补配对；而5则可相对不严，甚至还可做一些修饰，如附加限制性内切酶的位点，引入突变位点等。,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,

8、 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突变,将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR与

9、其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。,（四）DNA序列测定,（五）基因突变分析,PCR - 限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP),PCR-RFLP： PCR扩增包含待测位点的DNA片段 用识别该位点的限制性内切酶水解 琼脂糖凝胶电泳观察结果。,如果疾病的相关基因突变后引起了酶切位点的改变，则可用该技术诊断。,TAGAG,TACAG,正常,突变,突变,正常,Marker,碱基点突变后引起了酶切位点消失。,碱基无突变，保留原有酶切位点。,逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 R

10、T-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆转录PCR技术,三、几种重要的PCR衍生技术,原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,（二）原位PCR技术,（三）实时PCR技术,实时PCR(real-time PCR)技术通过引入荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号

11、进行实时分析，即可计算出PCR产物量。通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，可以精确计算出样品中最初的含量。亦被称为实时荧光定量PCR。,实时PCR分类：,加入能与双链DNA结合的荧光染料,图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图,第三节,基因文库 Gene Library,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library),基因文库(gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,目的：一是为了保存住现有的物种基因； 二是为了研究的时候不用去原生物体内提取。,一、基因组DN

12、A文库,基因组DNA文库是指某生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的随机克隆群体集合。,用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的随机克隆群体集合，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、cDNA文库,基因组文库的构建：,用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样的一套克隆便称作基因组克隆，

13、而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库。,cDNA文库的构建：,首先以某生物所有的mRNA为模板，在逆转录酶及其他一系列酶的催化作用下获得双链DNA，再与适当载体连接成重组体并转化到宿主细胞内进行扩增，由此而构包含着相应基因编码序列的一群克隆。每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列。 cDNA文库只包含在特定组织或细胞类型中已经被转录成RNA的所有的基因序列。,基因组文库和cDNA文库的构建和筛选,基因克隆的筛选：,大型基因组文库一般由数十万甚至上百万信重组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并不是件容易的事。 一，表型筛选法： 一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基

14、因）可以赋予宿主特定的表型，可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法）直接筛选，宿主多为突变体。,二、杂交筛选和PCR筛选,可用基因本身的部分序列，异源物种的同源基因序列、蛋白氨基酸序列反翻译推导的核苷酸序列作探针进行杂交筛选。 PCR筛选是将文库贮存于多个384孔板中，首先通过PCR确定目标基因所在的特定PCR板，然后通过PCR确定目标基因在特定PCR板上的特定行和列，最后通过逐个克隆的PCR确定目标基因所对应的克隆子，,三、免疫筛选,首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来筛选目标基因所在的表达文库，得得目标基因所对应的克隆子。方法有原位检测和免疫沉淀检测。,基因文库的保存：,

15、文库的长期保存在-80进行。,第四节,生物芯片技术 Biological Chip Technique,是指将许多特定的序列已知的DNA片段以原位合成或显微打印手段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果（样品分子的数量和序列信息）。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),(1)根据固相支持物的不同，DNA芯片分为无机(玻璃、硅片、陶瓷等)和有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、

16、尼龙膜等)芯片。 (2)根据芯片上所用探针不同分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。 (3)根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、微矩阵芯片(分喷点和针点)和电定位芯片3类。 (4)根据用途的不同分类为基因表达芯片和基因测序芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片。,基因芯片的分类：,基因芯片工作流程示意图,例：基因芯片用于测序,例：基因芯片用于测序,TACGTTAG,ACGTTAGA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,例：基因芯片用于测序,TACGTTAG,ACGTTAGA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,杂交探针组,ATACGTTAGATC,TATGCAATCT

17、AG,重组的互补序列,待测的靶序列,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应,蛋白质芯片(protein chip),蛋白质芯片作用原理,虽然DNA芯片技术已经被逐渐应用于对生物样品中的各种已知或未知的核酸序列表达的检测和比较研究。 但是，作为生物体细胞中实施化学反应功能成分的蛋白质，其相当部分与活性基因所表达的mRNA之间未能显示出直接的关系，因此使作为高通量基因表达分析平台的cDNA芯片技术的应用受到一定的限制。 另外，由于蛋白质结构和构

18、象方面的各种微小的化学变化均能引起活性或功能的改变，为了进一步揭示细胞内各种代谢过程与蛋白质之间的关系以及某些疾病发生的分子机理，必须对蛋白质的功能进行更深入的研究。蛋白芯片技术应运而生。,蛋白质芯片的提出,蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质发生亲和反应的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。,蛋白质芯片的原理：,第五节,生物

19、大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交

20、技术的基本原理和用途,本技术的建立是基于对酵母转录激活因子GAL4分子的认识。 GAL4分子有DNA识别区（BD）和促进转录的活性区（AD），这两个区域如果被分开将失去对下游基因表达的激活作用，但如果分开后的BD和AD又分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,酵母双杂交系统的应用,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。,酵母细胞作为宿主细胞的优点：,1、易于转化，便于回收扩增质粒。 2、具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因。 3、酵母的内