生物化学课件：第13章DNA的生物合成

1、,DNA,Replication,RNA,Replication,Reverse Transcription,Protein,Translation,Transcription,Central dogma,DNA的生物合成(复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 13 章,DNA复制(replication) 是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板合成两个完全相同的子代DNA的过程。,DNA指导的DNA合成 DNA复制概述,第一节,DNA复制的特点 复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 半不连续复制(semi-dis

2、continuous replication) 双向复制(bidirectional replication),一、半保留复制,DNA生物合成时，亲代DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T

3、 A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代D

4、NA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、复制的半不连续性,前导链 (leading strand),后随链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链（领头链）。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链（随从链）。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,原核生物复制时，DNA从起始点(

5、origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,三、双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。 习惯上把每个复制起始点到两边的终止点之间的DNA片段定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymeras

6、e): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,目 录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,一、解螺旋酶,原核生物复制起始的相关蛋白质,E. Coli 基因图,目 录,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 DnaB 六聚体结合在复制起始部位的DNA上，水解ATP供能解开双

7、链，并沿着复制叉移动。,二、DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目 录,三、单链DNA结合蛋白,单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中

8、维持模板处于单链状态并保护单链的完整,四、引物酶,引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶,五、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性（对碱基选择性） 2. 3 5 ，53核酸外切酶活性（校读功能）,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的

9、保真性至少要依赖三种机制,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,（一）原核生物的DNA聚合酶,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,7,1,亚基数,+,-,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E. Coli中的DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段

10、,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,The model of DNA-pol III, form the catalytic core, Links two cores, act as a clamp,DNA-pol ,功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶

11、，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,六、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,DNA复制的过程 Th

12、e Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1. 复制起始点的辨认结合,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的

13、方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,目 录,前导链的合成,目 录,后随链的合成,目 录,目 录,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,目 录,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,目 录,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性

14、，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5

15、,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,端粒酶,在大多数的正常人的体细胞中没有活性 近年来的研究发现： 衰老者端粒缩短 大约在85%-95%的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性（端

16、粒酶阳性） 提示： 端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性？ 端粒、端粒酶与癌症之间存在相关性？,端粒/端粒酶与衰老,端粒酶具有调控端粒长短的能力，其活性也随年龄大小而不同。年轻时，活性大，较容易延长端粒，这是年轻人不易显老的原因 男性端粒长度缩短略快于女性，这也是男性平均年龄低于女性的原因,端粒、端粒酶与癌症,研究染色体在肿瘤形成中的变化，发现： 人恶性肿瘤细胞：均呈现端粒酶活性 正常体细胞：检测不到端粒酶活性 统计资料表明： 84.8%的恶性肿瘤具有活化状态的端粒酶， 仅在4.2%的正常组织、癌旁组织和良性肿瘤中端粒酶呈阳性 提示：端粒酶活性的变化与细胞恶化有关,DNA损伤的修复,第四节,基因组

17、DNA的分子结构改变或其序列的改变称为基因突变（gene mutation）或DNA损伤（DNA damage）。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,原因： 复制中发生错误 环境因素导致突变,引发突变的因素,自发性突变 物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,胸腺嘧啶二聚体,High Energy Radiation causes even more damage,引起DNA损伤的化学因素,目 录,脱氨剂：亚硝酸、亚硝酸盐、亚硫酸氢钠 烷化剂：氮芥、环磷酰胺、硫酸二甲酯 碱基类似物：6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶 芳香类化合物：多环芳烃、芳香胺类化合物 羟胺

18、化合物：羟胺 染色剂：原黄素、吖黄素、吖黄 变质食物：色素添加剂、防腐剂 无机物：砷、石棉,引发突变的因素,自发性突变 物理因素紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射 化学因素 生物因素：黄曲霉素、病毒感染,二、突变的类型,碱基替换（原来称为错配) 移码突变：缺失、插入 重排 动态突变（三核苷酸重复扩展）,DNA分子上的碱基替换称点突变(point mutation)。,（一）碱基替换,碱基替换的后果,同义突变 错义突变 无义突变 通读突变,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,（二）移码突变和缺失、插入,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分

19、子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,移码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致移码突变 。,Frame shift mutation （移码突变）,5. TCACGACATATG.3,5.TCAGCGACATATG.3,5. TCAGACATATG.3,insert,delete,normal,Frame shift is the most serious mutation!,飞鸟尽，良弓藏，矫兔死，走狗烹，敌国灭，谋臣亡,飞鸟良,弓藏矫,兔死走，狗烹敌，国灭谋，臣亡,（三）重排,DNA分子内较大片段的交

20、换，称为重组或重排,由基因重排引起的地中海贫血,（四）动态突变：三核苷酸重复扩展,短串联重复序列的拷贝数目的变化 如：亨廷顿舞蹈病:一种家族显性遗传型疾病。患者由于基因突变或者第四对染色体内 DNA上CAG三核甘酸重复序列过度扩张,造成脑部神经细胞持续退化，机体细胞错误地制造一种名为“亨廷顿蛋白质(多聚谷氨酰胺)”的有害物质。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）蛋白质分子的多态性 （四）发生遗传及其相关疾病 （五）突变导致死亡,三、突变的后果,四、DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,直接修复：裂口的修复、烷基的转移、光复活 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复,修复的主要类型,