《蛋白质工程设计》PPT课件.ppt

1、小组成员：雷文丽 李亚 刘苗,蛋白质工程 第三节 天然蛋白质的剪裁 第四节 全新蛋白质设计,在分子设计的实践中，常依据改造部位的多少将分子设计分为三类： 1定点突变或化学修饰法（小改） 置换、删除或插入氨基酸，依赖分子生物技术，是目前最广泛使用的方法 2拼接组装设计法（中改） 当前主要从基因水平上完成，又称“分子裁剪” 3从头设计全新蛋白质（大改） 从基因水平上，或直接进行化学全合成,第三节 天然蛋白质的剪裁,分子剪裁：指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或1个结构域。 方法： 1、将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上 2、将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生

2、出新的融合蛋白质。,应用 1、嵌合抗体 利用基因工程的方法对鼠源单克隆抗体进行改造使其人源化，鼠源抗体的V区与人源抗体的C区进行拼接形成人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原型； 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,2、人改型抗体 将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区。,结构与功能的容忍度 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度 Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23的突变体保留了酶的活性 Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠 这些结果说明不同的氨基序列具有

3、相近的设计的结构,第四节 蛋白质分子的全新设计,全新蛋白质设计：指基于对蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列出发，设计制造自然界不存在的全新蛋白质使之具有特定的空间结构和预期的功能。,蛋白质全新设计流程,蛋白质的全新设计内容：,1）蛋白质结构的从头设计-二级结构,2）蛋白质功能的从头设计-天然蛋白质功能的模拟,根据稳定不同类型蛋白质的相互作用力来设计不同类型的蛋白质，且已取得了明显进展，例如，离子通道纳米管、血红素结合蛋白、 氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。,蛋白质从头设计概念,从头设计：根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一

4、个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。,蛋白质结构的设计 1、二级结构模块单元的自组装 2、配体诱导自组装 3、通过共价交叉连接实肽的自组装 4、在合成模板上肽的自组装 5、线性多肽折叠为球状结构 6、基于基因库的全新蛋白质设计,一、蛋白质结构的从头设计,中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列 设计障碍：线性聚合链的构象熵,要使一个序列能折叠为确定的三维结构，设计的使用作用能必须超过构象熵。 方法： 1）使相互作用的强度与数目达到最大（理论基础：分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元） 2）通过共价交叉连接减小折叠的构象熵,螺旋是通过氢键达到结构稳定的，

5、单一螺旋在溶液中是稳定的。 螺旋设计使用的策略有： 1）使用大的形成螺旋倾向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸等 2）使用合适的集团去除端基电荷，防止与螺旋偶极不合适的电荷相互作用 3）使用极化或荷电氨基酸引入稳定的氢键或在螺旋中相隔一圈残基间的离子相互作用 4）使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的（脂肪的或芳香的）范德华相互作用 5）使用芳香-荷电或芳香-硫的相互作用,螺旋：,1、二级结构模块单元的自组装,最简单、最直接的策略：合成单一二级结构单元（螺旋或折叠股）作为多肽链的片段模块途径，复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。 优点：无论是从设计或合成看，都是简单的；容易合成缺点：

6、蛋白质的稳定性（熵较大，依赖浓度）；结构的简单重复,两条肽链自组装为有序的二聚体结构,螺旋,最简单的在自然界观察得到的螺旋结构是coiled-coil以及四螺旋束。,coiled-coil：Hodges及其合作者设计（周期性重复七肽）,四螺旋束,四螺旋束,coiled-coil和螺旋束差别： 共同之处：均为两亲性螺旋 不同点：coiled-coil含有一个狭窄的疏水面（疏水残基主要在7肽序列a和d位置），而螺旋束含有较宽的疏水面,2、配体诱导组装,使用一个配体（典型的是一个金属离子）诱导模块蛋白片段的组装。,配体诱导组装,3通过共价交叉连接实现肽的自组装,设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。

7、当几个没有连接的肽链进行自助装时，熵势垒比较难以克服。通过共价交叉连接可以减少构象熵。,被共价交叉连接所稳定的结构的组装,在自然界中唯一用于交叉连接的方法是二硫键。 在全新蛋白设计中也使用其他种类的交叉连接。例如Betabellin的设计中使用的DAB交叉连接方法，虽然DAB是二价的，但是DAB是非极性的，它会减少Betabellin在溶液中的溶解度，为此，二硫键连接代替DAB的交叉连接，得到Betabellin14D。,在合成模板上肽的组装,是一种模板组装合成蛋白方法，不使用天然蛋白中的turn和loops连接二级结构单元，而是使用人工模板。同天然线性蛋白质不同，螺旋和折叠股在一个特殊折叠过

8、程有一个正确的相对取向。 Mutter研究组使用的模板是寡肽，可形成两个反平行折叠股，通过一个在一端的Pro-Gly转折和一个在另一端的二硫键形成两个反平行的折叠股，在链的两端设计一个二硫键，形成一个环状结构。,5、线性多肽折叠为球状结构 不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球形的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一。 主要障碍：构象熵 实例:-螺旋 根据-螺旋的两亲性。形成的-螺旋显著稳定性是因为形成明显的疏水核，还有Glu 和Lys形成的盐桥，螺旋偶极的电荷中和，增加了在螺旋/转折连接处的柔性。,基于组合库的全新蛋白质设计,组合库设计的核心问题：埋藏疏水部分 常用方法：基于极性（P）

9、和非极性（N）氨基酸的 “二元模式”，“二元模式”一方面要 有利于形成二级结构，另一方面又要埋 藏疏水残基。 应用：二级结构两亲片断的构建（一面完全是极性 残基，另一面完全是非极性残基）。,利用组合库方法寻找全新蛋白质已在如下方面取得成功：螺旋；折叠片；单体；自组装为有序的排列；堆积为天然类蛋白质；超热稳定性；结合辅因子的能力；催化活性。,二、蛋白质的功能设计,蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化，达到这一目的，可以采用两条不同的途径： 1、反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能； 2、从头设计功能蛋白质。,蛋白质的功能设计 通过反向拟

10、合天然蛋白质设计新的功能 键合及催化的从头设计 在全新蛋白质中引入结合位点 催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计,通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能,执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合获得新的活性。通过修饰天然结构得到专一性及活性改变的天然蛋白质是可能的，目前在以下范围已取得成功：DNA结合专一性；改变辅因子的专一性；改变底物的专一性。 反向拟合的能力大于仅仅改变专一性的修饰。事实上，它能把新奇的性质附加到原蛋白质骨架的结构上。实例有： 1）引入金属结合位点 2）位点专一DNA裂解,键合及催化的从头设计,23个氨基酸自动折叠成的锌指结构（5）的核磁共振（NMR）结

11、构(Struthers et al., 1996, 1998)； 5同源四聚体衍生物T2的X-射线结构（Ali et al., 2004)； T2异源四聚体衍生物hetT1的X-射线结构 (Ali et al., 2005).,型异源四聚体的设计历程,在全新蛋白质中引入结合位点,全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外，还要设计新的结合位点（金属位点、血红素结合位点等）及催化性质。,新的金属结合位点,催化活性蛋白质的设计,这类设计的早期代表性工作是Chymohelizyme及Helichrome。两个设计蛋白质的催化位点与天然酶类似，在Chymohelizyme中设计的活性位点，是模拟胰凝乳蛋白

12、酶在Helichrome中的卟啉环类似于血红素蛋白的活性位点。两个设计均使用人工交叉连接预组织结构并使活性口袋的位置接近催化活性部分。,后来又设计了人工脱羧酶（ART-OAD） 放置一个赖氨酸在两亲螺旋极面上并非常接近其他赖氨酸链，使中心的赖氨酸作亲核试剂，支架上的赖氨酸是荷正电能与荷负电的底物成键。CD谱以及NMR谱研究表明，螺旋占优势。它的二级结构依赖于浓度，表明两亲螺旋的组装体为期望的多聚体（可能是四聚体）。它的Km（14mmol/L)类似于天然酶（Km=4mmol/L)。合成肽的Kcat（0.4min）比天然酶慢5个数量级但仍比脱羧反应快900倍。,5、膜蛋白及离子通道的设计 一个全新膜蛋白从一个不溶于水的聚集体转化为类似于膜的环境要求构象变化。 Montal等设计了一系列模拟天然离子通道特征的全新蛋白质，这些合成的微孔蛋白质称为Synporin，是使用Mntter的模板模拟方法。4条相同的23肽螺旋被固定在载体模板上，并且相互平行。,Synporin结构,CD谱研究结果表明，101个残基的Synporin主要是螺旋。形成的离子通道具有如下特点：单通道；能区别不同的阳离子；在毫秒时间范围内打开与关闭；对局部麻醉通道阻塞剂是敏感的。 Lear等设计并合成了含有简单两亲螺旋的离子通道，其具有的特点是：序列与天然离子通道序列不同；