蛋白质含量测定方法简介.ppt

1、第一部分 蛋白质含量测定方法简介 一、双缩脲法测定蛋白质的含量 （一）目的与要求 1.掌握双缩脲测定蛋白质含量的原理与方法； 2.了解比值法在物质定量测定中的应用。 （二）实验原理 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中能与Cu2+产生紫红色的络合物（吸收波长540nm)，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应。溶液颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故双缩脲反应可用于蛋白质含量的测定。 类脂、色素等干扰比色，本实验用加入四氯化碳的办法消除这一干扰。,（三）方法 1.比值法 A=kc 本次方法 A标= kc标 （1）

2、 A样 =kc样 （2） （1）式 （2）式 得： A标 A样 = c标 c样 ？ c样 = A样c标 A标 2.标准曲线法,C（有色溶液中被测成分浓度）,A,溶液吸光度,（四）思考题 1. CCl4在本实验中的作用是什么？ 2.此法与标准曲线法比较有何优缺点？,二、几种蛋白质定量测定方法比较,三、思考题 1紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？ 2若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 3.试说明考马斯亮蓝G250法的优缺点。,一、概念、用途、设备和基本操作 1.概念：离心技术是利用离心机旋转时产生的强大离心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。,2

3、.用途： 分离细胞器、大分子物质； 固、液相分离； 测定某些纯物质的个别性质。 3.设备：离心机 4.基本操作：,第二部分 离心技术简介,（1）将待分离的物质悬浮于一定的介质中，装入离心管； （2）精确平衡之后，对称放置于转头的插孔中； （3）当转头旋转时，各种物质粒子在离心力作用下因各自大小、形状和密度的差异而以不同速度沉降，一段时间后，即被分离。,二、离心（centrifugation）分离的基本原理,t:沉降时间 h:悬浮介质的黏度 rp:颗粒半径 rp:颗粒密度 r：介质密度rt:旋转中心到液面的距离 rb:旋转中心到管底的距离 - 角速度,1. 粒子的沉降速度,由公式可知，在一定离心

4、场中，颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密度和颗粒大小而分离。,2. 相对离心力 (relative centrifugal foce RCF),离心场产生的离心力的表示： 习惯使用法：转速 转/分（r/min） 缺点：如果旋转半径不同，则粒子所受的离心力不同,标准法：相对离心力（RCF ） 表示方法：数字g g为重力加速度，即相对离心 力为重力加速度的倍数 如：10000g 相对离心力与转速的换算 计算法 RCF = 1.11910-5（r/min)2rg 图表法 根据旋转半径（r）、RCF、r/min 的列

5、线计算图进行换算,RCF与r/min列线计算图,已知r和r/min求RCF,已知r和RCF求r/min,三、离心机 (centrifuge),1. 制备离心机,2. 分析离心机 属于超速离心机，具有光学观测系统。,制备离心机适用范围,四、转头,1. 水平（甩平）转头,2. 角式转头,3. 垂直管转头,4.不同转头中粒子的轨迹,角式转头,5.注意事项 各种转头的离心管腔的大小、形状均有许多规格，以适应各种转速、样品量、分离目的、分离方法。需要注意： （1）每个转头都有一定的使用限度（次数，运转时间）。 超过限度使用，其最大额定速度应降低10%。 二次超限使用，再降10%。 每个转头必须单独建挡，

6、记录使用次数和最大速度下的使用时间。 （2）转头上标定的最大额定转速是有条件的。 一般应严格按条件操作。,五、常用离心技术,1. 沉淀离心 选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机 2. 差速分级离心 在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。,如线粒体的分离：,原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。,3.区带离心法,分类： 差速区带离心法 等密度区带离心法,（1） 差速区带离心法,根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分层。,(2) 等密度区带离心法,根据微粒的不同密度而分层。,用途：是制备高纯度物质的常用方法 特点：高纯度、高分辨力； 不足：复杂,密度梯度材料： 要求：无毒；合理的密度范围；易于颗粒分开。 类型：糖类（蔗糖）、无机盐（氯化铯）、硅溶胶（Ludox）、有机碘化物,思考题： 1.相对离心力为30，000g，转头平均半径为10cm,求转速r/min （rpm）? （两种方法:公式法;对数列表