RT-PCR及其产物电泳分析20161101.pptx

1、,RT-PCR及其产物电泳分析,中南大学 生命科学学院,实验目的,熟悉RT反应的原理；掌握RT反应的操作步骤 熟悉PCR反应的原理 掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化 掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法,实验原理,RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退火；（3）延伸 。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过

2、程，是检测基因表达最常用的方法。,RT反应试剂,（1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%） （2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ） （3）RT反应缓冲液：常用5浓度。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 （6）RNasin,PCR反应试剂,（1）引物：一对，单链的10-30nt长的DNA片段。 （2）Taq DNA聚合酶 （3）PCR反应缓冲液：常用10浓度，一般组成为15mmol/L MgCl2、250m

3、mol/L KCl等。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板,6,RT-PCR原理,微量移液器,台式微量离心机,电泳槽,凝胶成像系统,主要仪器,电泳仪,热循环仪,实验步骤,（1）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入： RNA溶液 5 L RT mix 15 L 20 L （2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心 30 s，使反应成份均匀富集于管底。 （3）42 水浴30 min 。,RT mix的成分：RNasin、5RT反应缓冲液、2.5mM dNTPs、Oligo(dT)16、逆转录酶(MMLV),实验步骤,（4）标

4、记一个洁净的200L反应管，向其中依次加入： ddH2O 6 L 2PCR mix 10 L Primer mix 2 L cDNA模板 2 L 20 L （5）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。,PCR mix的成分：PCR反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、Taq DNA聚合酶,实验步骤,（6）在PCR仪上设置反应循环参数: 本次实验为：94 20 s，56 20 s，72 20 s，循环数为26，最后于72 充分延伸5 min后，终止反应。 （7）置反应管于PCR仪上进行热循环。 （8）反应完毕后，取5 LPCR产物，于1.5 琼脂糖凝胶电泳检测结果。,注意事项,1.

5、戴手套操作，避免污染。 2. 尽量冰上操作。 3. 取样准确，体系正确。 4. 一定要有内参。,PCR平台期,PCR扩增有限性-平台期,经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA分子数不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。,PCR的离子需要,Taq酶活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 一般PCR反应中MgCl2浓度在2.0mmol/L时酶活性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑制。 变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。,PCR引物用量,一般PCR反应引物的终浓度为0.21m

6、ol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。 但引物低于0.2 mol/L时，则产量降低。 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。,结果分析,M 1 2 3,M：100bp 梯级DNA分子量标志物；泳道1：阳性对照； 泳道2：靶DNA扩增； 泳道3：阴性对照,图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳,观察结果： 是否有扩增产物。 如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。 分子量标准电泳后区带是否分开。 与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确。 PCR产物的产量。 引物二聚体。,RT-PCR检测人-actin基因表达（扩增产物长度 260 bp）,问题及解决方

7、法,无PCR产物 1. 确保mRNA无降解。 2. 确保酶未失活。 3. 确保引物无降解。 4. 重新设置退火温度。 5. 重新设置变性温度。,问题及解决方法,PCR产物呈拖尾现象 1. 提高退火温度。 2. 减少Taq DNA聚合酶的用量。 3. 试用二步法进行PCR扩增。 4.调节Mg2+浓度，使之最优化。Taq DNA聚合酶发挥活性需要Mg2+参与，通过Mg2+介导与模板DNA、引物及dNTP结合。通常Mg2+浓度为0.52.5mM，Mg2+浓度过高，将引起非特异扩增产物增多；反之，Mg2+浓度过低则导致产量降低。 5. 减少延伸时间。 6. 减少循环次数。 7. 设计新的引物。 8.采

8、用热启动法进行PCR。,问题及解决方法,引物二聚体 1. 防止引物3端互补。 2. 设计较长的引物。 3. 增大模板的量。PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高，模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。 4. 降低引物浓度。一般为0.10.5M。引物浓度过高，将错误启动延伸（即错误引发），导致非特异性产物堆积，还可形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。 5. 减少循环次数。 6. 提高退火温度。,PCR体系的优化,PCR循环参数的优化, 变性 95变性2030秒即可使双链模板DNA完全解链为单链，变性温度过高和过低均会导致DNA聚合酶活性的丧失。 退火 引物与模板的退火温度有引物的长度及GC含量决定。退火温度由Tm值确定：Tm4（G+C）+2(A+T), 退火温度比Tm低312。 延伸 延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度（7075；延伸时间由扩增片段的长度决定（500bp 30s,500-1200bp 40s）。 循环次数 PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为2535次，PCR产物可达最大值。,PCR体系的优化,PCR反应成分浓度的优化 Taq DNA聚合酶：12.5U/100L反应液。 dNTP浓度：20200mol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机会。 Mg2+浓度 ：0.52