生物化学课件：临床 第十一章 RNA的生物合成

1、同学们下午好,主讲:叶辉 博士 副教授 教研室主任,单位：温州医学院生化教研室,蛋白质,遗传信息传递的中心法则 （central dogma）,DNA,RNA,Francis Crick (1916-2004 ),第三篇 基因信息的传递,主要内容,第十章 DNA的生物合成-复制 第十一章 RNA的生物合成-转录 第十二章 蛋白质的生物合成-翻译 第十三章 基因表达调控 第十四章 基因重组与基因工程,第 十 一 章,RNA的生物合成 RNA Biosynthesis, Transcription,在生物界，RNA的生物合成有两种方式：,转录： 以DNA为模板的RNA合成，是生物体内的主要合成方式

2、（本章介绍的主要内容）。 RNA复制： 以RNA为模板的RNA合成，常见于病毒(除逆转录病毒) 。,转录 (transcription),生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录,RNA,DNA,此过程把DNA的碱基序列转抄成RNA 。,编码链,模板链,转录与复制的区别,参与转录的物质,原料: NTP,模板: DNA,酶: RNA聚合酶 RNA polymerase, RNA-pol,其他蛋白质因子及二价金属离子,原核生物转录的模板和酶 Templates & Enzymes in Prokaryotic Transcription,第一节,一、原核生物转录的模板,DNA分子上转录出RN

3、A的区段，称为结构基因。,不对称转录(asymmetric transcription),转录对DNA链的选择性称为不对称转录。 有两方面的含义： 在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,模板链、编码链与转录及翻译的关系,DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作

4、有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,模板链,编码链,编码链,模板链,模板链和编码链的相对性,二、RNA合成由RNA聚合酶催化,（一）RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成,DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNA； RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延长的RNA,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。 RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子(promoter)

5、结合后，就能启动RNA合成。,（二）RNA聚合酶由多个亚基组成,转录起始阶段,转录延长阶段,操纵子：转录单位或转录区段,启动子,RNA-Pol,三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起动转录,转录是不连续、分区段进行的。 每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为启动子（promoter）。 启动子序列通常由一些带共性的保守序列构成。 对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。,RNA聚合酶保护法,3、核酸酶消化 水解

6、未保护DNA,4、蛋白酶消化RNA-Pol 释放被保护的DNA,DNA分子,1、分离一段基因片段,2、加入纯化RNA-Pol,用RNA聚合酶保护法研究转录起始区,RNA聚合酶的移动,-40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 +1 +5 +10 +15 +20 +25,启动子保守序列,开始转录,转录起始点,原核生物的转录过程 The Process of Transcription in Prokaryote,第二节,RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、转录起始需要RNA聚合酶全酶,转录起始需解决两个问题：,R

7、NA聚合酶的移动,-40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 +1 +5 +10 +15 +20 +25,启动子保守序列,开始转录,转录起始点,原核生物的转录起始过程,亚基识别-35区,RNA pol 全酶移向-10区及转录起始点，打开双链,亚基催化合成第一个磷酸二酯键,5-pppGpN-OH-3,形成转录起始复合物,RNA pol(2) DNApppGpN-OH,（结合松弛）,（结合紧密）,转录起始不需引物！,原核转录起始,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA-pol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,二 、 转录延长（顺藤摸瓜，照葫

8、芦画瓢）,1. 转录起始，即第一个磷酸二酯键形成后，亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,1、 转录空泡,RNA-Pol（核心酶）-DNA-RNA形成的转录复合物 转录解链范围10-20bp,NMP逐个加入遇到模板为A时加入的是U不是T RNA-Pol向下游移动时RNA 分子5pppG的 结构仍然保留,RNA聚合酶,核糖体,RNA,2、原核生物转录过程中的羽毛状现象,依赖Rho ()因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,指RNA聚合

9、酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,三、转录的终止,因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。 因子能结合RNA，又以对poly C的结合力最强。 因子还有ATP酶活性和解螺旋酶的活性。,(一) 依赖因子的转录终止,因子：,因子的作用原理：,因子终止转录的作用是：与RNA转录产物结合，结合后因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放 。,（二） 非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成

10、特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,近终止区的转录产物形成发夹结构是非依赖因子终止的普遍现象。,茎环结构使转

11、录终止的机理：,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,真核生物的转录过程 The Process of Transcription in Eukaryote,第三节,真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。,一、真核生物的RNA聚合酶,转录产物,对鹅膏蕈碱反应,耐受 （不敏感）,极敏感 （低浓度）,中度敏感 （高浓度）,(C),(B),(A),45SrRNA,HnRNA,5S-rRNA tRNA snRNA,RNA聚合酶,存在部位,核仁,核质,核质,（mRNA前体）,（除5S rRNA外，其它rRNA前体）,二、转录起始,

12、（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。 （二）转录因子 转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,（三）转录起始前复合物,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,（四）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录,转录因子的相互辨认结合，恰如儿童玩具七巧板那样，搭配得当就能拼出多种不同的图形。,为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。 拼板理论(piecing theory) ： 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再

13、与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,真核生物转录起始（动画）,三 、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,转录延长中的核小体移位,RNApol前移将遇到核小体,原来绕在组蛋白上的DNA解聚及弯曲,一个区段转录毕，核小体移了位,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,在转录越过修饰点后，RNA链在修饰

14、点处被切断，随即进行加帽和加尾修饰。,真核生物的转录终止及加尾修饰,真核生物RNA的加工 Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA,第四节,5端帽子结构(m7GpppGp ),一、真核生物mRNA的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）前体mRNA在5-末端加入“帽”结构,5 pppGp,帽子结构的生成过程：,帽子结构的生成过程：,帽子结构的意义：,可以使mRNA免遭核酸酶的攻击； 也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,加入pol

15、yA,切去3端过剩碱基（核酸内切酶）,功能：增加mRNA的稳定性，维持mRNA作为翻译模板的活性(与mRNA寿命有关),（二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,AAUAAA,G/U,5,3,Poly(A)信号,Poly(A)位点,mRNA,CPSF,G/U,5,3,CPSF,CFI,CFII,CStF,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,ATP,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,mRNA,DNA,（三）前体mRNA的剪接主要是去除内含子,mRNA,mRNA,mRNA来自hnRNA,核酸序列分析证明： mRNA是去掉

16、大部分中间片段的hnRNA。 核酸杂交实验证明： hnRNA与DNA模板链可以完全配对； 而mRNA与DNA模板链杂交则出现部分配对的局部双链区域和中间相当多的鼓泡状突出的单链区段。 因此提出真核生物基因的断裂性的概念。,DNA,mRNA,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,1. hnRNA和断裂基因,编码区 A、B、C、D,2. 外显子(exon)和内含子(intron),外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子：隔断基因的线性表达而在

17、剪接过程中被除去的核酸序列。,外显子,内含子,DNA,mRNA,转录,形成套索RNA，外显子靠近,并接体,去除套索RNA，外显子连接,成熟mRNA,胰岛素基因、转录产物、翻译产物,胰岛素基因（编码链）,intron,intron,S,B,C,C,A,Pre,成熟mRNA,S,B,C,A,Pre,转录后加工产物,前胰岛素原,翻译产物,翻译后加工修饰产物,S,B,C,A,Pre,胰岛素,B,A,3. mRNA的剪接过程：, snRNP与hnRNA结合成为剪接体。, 剪接体结构调整，U2和U6形成催化中心，发生转酯反应。,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应,剪接过程的二次转酯反应,4. 真核生物前体mRNA分子经剪接和剪切两种模式可加工成不同的mRNA,（四） mRNA编辑是对基因的编码序列进行转录后加工,第2153位密码 子CAAUAA,载脂蛋白B mRNA的编辑,参与细胞内脂类的运输,参与以乳糜微粒形式携带食物中的脂类,二、真核前体rRNA的加工,三、真核生物前体tRNA的加工包括把核苷酸的碱基修饰为稀有碱基,tRNA前体,tRNA核苷酸 转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,具有酶促活性的RNA称为核酶。（详细内容见第三章