研究生课程-分子生物学基本操作技术.ppt

1、分子生物学基本操作技术,从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,核酸凝胶电泳技术,自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到

2、科学界的高度重视。 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相

3、同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,大分子量的DNA 移动的慢,小分子量的DNA 移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA加样孔,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DN

4、A的快速连接等,1）凝胶浓度选择,琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,2）电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,10,4）上样缓冲液,指示剂

5、一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液 作用： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,5）核酸电泳的染色剂,在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微

6、量DNA，也可以被清晰地检测出来。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间,称样,溶解,加热,制板,倒胶,6）核酸电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,核酸电泳操作基本程序,结果,一、PCR技术原理 二、PCR技术主要类型 三、PCR技术主要应用,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。,一、PCR技术原理,PCR技术简史,DNA的复制

7、 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在许多作品中，包括1990年在科学美国人上的一篇文章，及1998年的自传心灵裸舞（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。,“顿悟”,那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。,PCR技术的发明,PCR的

8、发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路 行驶的汽车 1988年发明了PCR技术 1993年获诺贝尔奖,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,PCR 发明不到 10 年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。1991 年，期刊“PCR 方法与应用”（PCR Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR 技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学

9、各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,29,72,94,55,PCR循环,PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先将待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断

10、重复。,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Seq

11、uence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Po

12、lymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416

13、532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR仪,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万

14、倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第

15、1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR反应五要素（反应成分）,引物（primers） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,1）引物 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,引物设计的原则,引物长度： 15-

16、30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物特异性 引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb片段 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,引物设计的原则,避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带 引物3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PC

17、R失败 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处,引物设计的原则,引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量： 每条引物的浓度0.2 1umol，以最低引物量产生所需结果为佳 引物浓度偏高会导致错配和非特异性扩增，且又增加引物之间形成二聚体的机会,DNAstar Primer premier,Software for primer design,依靠经验直接设计,2）酶及其浓度,目前有两种Taq DNA聚合酶供应 天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指

18、总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,4）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量

19、下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2、循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR中应注意的事项,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对

20、照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,二、PCR技术主要类型,PCR技术的主要类型,1、反向PCR 6、锚定PCR 2、不对称PCR 7、原位PCR 3、RT-PCR 8、重组PCR 4、差异显示PCR 9、免疫PCR 5、实时定量PCR10、多重PCR,RTPCR 反转PCR （RT-PCR）是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性，克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩

21、增,PCR技术应用,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,细菌转化与目标DNA分子的增殖,一、细菌转化 二、细菌转化方法 三、克隆的筛选和鉴定,一、细菌转化,细菌转化（Transformation）:,一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这

22、种处理的细胞被称为感受态细胞（Competent Cell）。,1、常用细菌转化的方法-CaCl2法,将快速生长中的大肠杆菌置于经(0）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。,42下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。,二、细菌转化方法,CaCl2法制备感受态细胞及转化过程：细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形 ，制成感受态，经42短时间热冲击处理能提高转化的效率。,其中的钙离子的作用机理（假说）：,（1）改变了细胞壁的通透性（用氯化钙处理大肠杆菌

23、，增加大肠杆菌细胞壁的通性） ：使细胞壁局部原生质化，增加细胞壁的通透性,（2）改变了细胞膜的通透性,低温的CaCl2溶液中 ，（1）Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构 ，当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。（2）促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上,三、克隆的筛选和鉴定,1、抗生素,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,2、-互补蓝白斑筛选法,实验

24、室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程,RNA基本操作技术,（Techniques for RNA Manipulation）,一、 总RNA的提取,二、 cDNA的合成,RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。 由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（Complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异

25、性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。,一、 总RNA的提取,细胞中的总RNA包括信使RNA (mRNA) 、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)以及一些非编码的小RNA。一个典型的动物细胞约含有10-5g RNA，其中rRNA占80%85%，tRNA和非编码小RNA占15%20% ， mRNA 占1%5%。,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的

26、完整性。,常用的RNA提取方法,1、常用提取方法的种类,总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,由于RNA酶存在于所有

27、的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。,2、注意事项,纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.8-2.0之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40g/mL，寡核苷酸为20g/mL。,RNA的纯度、浓度与完整性,1、RNA的纯度,2、RNA的浓度,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较

28、好。,3、RNA的完整性,二、 cDNA的合成,使用Oligo dT Primer时的cDNA合成,缺陷：不具有ploy（A）尾结构的mRNA无法使用此方法！,基因克隆,一、基因克隆的策略 二、基因克隆技术,克隆 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之

29、得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,一、克隆基因的策略,1.如何克隆已知基因 2.如何克隆同源基因 3. 已获得未知蛋白, 如何克隆其基因 4. 转座子标签法克隆基因 5.定位克隆(positional cloning) 6.差减杂交法（subtructive hybridization cloning),如何克隆已知基因 （1）如果该基因为连续基因，没有内含子，以基因组DNA为模板 如果该基因为断裂基因，有内含子，提取总RNA（包括了mRNA）,以此为模板 原核基因一般没有内含子 （2）设计上下游引物，进行PCR反应 （3）电泳回收PCR产物 （4）与载体连接、测序、转化宿主进行表达,88,全长cDNA及基因结构与功能分析和鉴定,获得了大