各种酶活性测定方法

1、.各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD 测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase， SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（ NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。 在有氧化物质存在下， 核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而 SOD可清除 O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦

2、叶片（二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2.分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx ）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L甲硫氨酸（ Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3.750 mol/L氮蓝四唑溶液： 称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100 mol/L EDTA Na 2 溶液：称取0.03721gEDTANa 2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml ； 5. 20 mol/L 核黄素溶液：称取0.

3、0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml 。取 1.5 2ml 于 1000rpm 下离心 20min ，上清液即为SOD 粗提液。2. 显色反应取 5ml 指形管（要求透明度好）4 支， 2 支为测定管，另2 支为对照管，按下列加入各溶液： 试剂（酶）用量（ ml）终浓度（比色时） 0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet 溶 液 0.313mmol/L750 mol/L NBT溶 液0.375 mo

4、l/L100 mol/L EDTA Na2液0.310 mol/L20 mol/L 核黄素0.320 mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25 总体积 3.0 混匀后将1 支对照管置暗处，其它各管于4000Lx 日光下反应 20min （要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD 活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知 SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 SOD 总活性 (A ckEV/(Ack0.5t A )W V )上式中， SOD 比活力

5、 SOD 总活性蛋白质含量式中SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位 mg 蛋白表示 Ack 照光对照管的吸光度AE 样品管的吸光度 V 样品液总体积（ ml ）Vt 测定时样品用量（ml ）W 样鲜重（ g）蛋白质含量单位为： mg 蛋白 g 鲜重。.SOD、 POD、CAT、 MDA的测定方法 - 非试剂盒法缩写： SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；POD：过氧化物酶；MDA：丙二醛； PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30； L-Met ：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸； PBS: 磷酸缓冲液1. SOD 的测定方法加样顺序：（V=3

6、ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml核黄素： 0.3ml酶液： 0.05ml 蒸馏水： 0.25ml试剂配制：(1)0.05mol/L PBS： pH7.8(2)130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用 PBS定容至 100ml(3)750mmol/L NBT: 0.06133g用 PBS定容至 100ml( 避光保存 )(4)100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用 PBS定容至 1000ml(5)20umol/L 核黄素 : 0.0753g用蒸馏水定容至 1000ml( 避光保存 )注：

7、（ 1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560 值2.MDA的测定方法试剂配制：（1） 5% TCA： 5g 用蒸馏水定容至500ml（ 2） 0.5% TBA： 2.5g 用 TCA定容至 500ml方法：酶液 1ml 3ml0.5%TBA和 5%TCA混合后在100 度水浴煮沸15min 迅速冷却， 10000r/min离心 10min用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、 600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制 ：（ 1） 0.1mol/L 的醋酸缓冲液： 8.8mlA+41.2mlB 得到 100mlph5.

8、4 的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的 HAc 溶液 ) 6ml 冰醋酸溶到 494ml 蒸馏水中B(0.2mmol/L的 NaAc 溶液 ) 13.6gNaAc.3H2O（ 2） 0.25%愈创木酚溶液 125um愈创木酚溶于 50ml 50%乙醇中（ 临用前配制 ）（ 3） 0.75%H2O2溶液： 1.25ml 30% H2O2 定容至 50ml（临用前配制 ）方法： 比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液1ml 0.25% 愈创木酚溶液xml 酶液（5min 值为 500-800 即可） 0.1ml 0.75%H2O2 溶液迅速巅到混匀把A460 调零并开始计时 1 次

9、 /30s, 连续读取3min4.CAT 的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的 PBS（ pH7.0 ） (2) 0.3% H2O2 1ml H2O2 定容至 100ml方法： (1) 以不加 H2O2的 50mmol/L 的 PBS（ pH7.0 ）为空白把A240 调零(2)50ul酶液 3ml 50mmol/L 的 PBS（pH7.0 ） 0.2ml 0.3% H2O2 迅速颠倒混匀，开始计时 1min 后在 240nm下比色， 1 次 /1min( 连续读取5min) 。2010 年 06 月 22 日 星期二 19:33.1 叶绿素含量测定：80的丙酮液的配制：4L 丙酮+

10、 1L 蒸馏水。称 0.5g 左右的叶片放在50ml 的离心管（做三个重复），加入 25ml 浓度为 80的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36 小时后取出，稀释 4 倍后分别在波长663nm、645nm、652nm 和 470nm下测定光密度，以80的丙酮液为空白。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ,P3536）也可用 95%乙醇溶液，在665、 649、 470nm 处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g 样）0.05mol/L 磷

11、酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8 ）溶液的配制： 65.5506g Na2HPO4 12H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到 4L。（参考陈建勋， 王晓峰主编的 植物生理学实验指导 ，P134）。取低温保存的鲜样， 称 2g 左右的叶片（或根）放在 50ml 的离心管，加入 20ml 浓度为 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 （ pH=7.8 ）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液， 防止研磨时温度过高使酶失活） ，研磨（用磨碎机磨） ， 8000r/min 的冷冻离心机下离心 20 分钟，上清液为粗酶液。2.1 丙二醛（ MDA ）的测定：20三氯乙酸（TCA ）溶液的配

12、制：称200g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml 。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸 （ TBA ）溶液的配制：称 5g 硫代巴比妥酸 （ TBA ）,用 20三氯乙酸（TCA ）溶液溶解并定容到 1000ml 。（参考陈建勋， 王晓峰主编的 植物生理学实验指导 ,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L 溶解）；0.5ml 酶液（对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=7.8 的磷酸缓冲液代替酶液） （做三个重复） + 3mlTBA 振荡 沸水浴上反应 30min 冷却（至少 30min ） 比色（ OD600 、OD532 、

13、OD450 ）。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导， P124）2.2 超氧化物歧化酶（SOD ）的测定：NBT(400ml) 混合反应液 :392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵 +8ml 核黄素溶液 +0.4ml EDTA-Na 溶液（100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素）。（另配） 100ml PBS 溶液加 EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取 3ml 反应液 +0.05ml( 根 )或 0.02 ml( 叶 )粗酶液，于光照培养箱中6-10 分钟，OD650下测定吸光度。2.3 过氧化物酶（

14、POD ）的测定：0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (PBS)（ pH=7.0）溶液的配制： 10.9251g Na2HPO4 12H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O, 定容到 1000ml 。0.3%H2O2 溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2 ，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml 。0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g 愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml 。2ml 0.3%H2O2 溶液+ 0.95ml 0.2% 愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/LpH=7.0

15、 磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml ？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml 酶液）（对照用0.05mol/L 磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复） ，记录 470nm 处 OD 降低速度。将每分钟OD 增加 0.01 定义为1 个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）.比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）00.10.20.40.60.81.0H2O （ ml ）1.00.90.80.60.40.20冰乙酸（ ml）2222222显色液（ ml）3333333脯氨酸含量（ l）.01246

16、8100.5ml 酶液（对照用 0.5ml 80 乙醇代替）（做三个重复）+ 1ml 冰乙酸+ 1.5ml 显色液 混匀，沸水浴15min ，冷却后测OD520 。2.5 可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的植物生理学实验指导）牛血清白蛋白：配成100g/ml 和 1000g/ml 。90乙醇： 90ml 乙醇+ 10ml 蒸馏水。？85（ W/V ）磷酸： 170ml 磷酸+ 30ml 蒸馏水。考马斯亮蓝G-250: 称 0.2g 考马斯亮蓝G-250 溶于 100ml 90乙醇中，加入85（ W/V ）磷酸 200ml ，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。标准曲线的制作：

17、配制 0 100g/ml 血清白蛋白血液管号123456100 g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量 (ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ ml ）00.020.040.060.08.0.10配制 0 1000g/ml 血清白蛋白血液管号789101112100 g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量 (ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ ml ）00.20.40.60.81.00.1ml 酶液（做三个重复）+ 5ml 考马斯亮蓝G- 250 混匀，放置2min 后在 595nm 下比色。2.6

18、过氧化氢酶（CAT ）的测定：0.3%H2O2 溶液的配制：吸5ml 30%H2O2 ，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液 (PBS)定容到500ml 。1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml酶液，测定240nm 处 OD 降低速度。将每分钟OD 减少 0.01 定义为 1 个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）2.7 抗坏血酸（ ASA ）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P125）5 三氯乙酸（ TCA ）溶液的配制：25g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml 。10 三氯乙酸（ TCA ）溶液

19、的配制：25g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml 。150mmol/L NaH2PO4 （ pH 7.4 ）溶液的配制：100ml 。44 H3PO4 溶液的配制：250ml 。4 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml 。.3 FeCl3 溶液的配制： 100ml。首先标制作准曲线。粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g 左右的叶片（或根）放在50ml 的离心管，加入15m 5三氯乙酸（ TCA ）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA ）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨） ， 15000r/min 的冷冻离心机下离心10 分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA ）

20、含量的测定。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 P125 126）测定： 0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4 （ pH 7.4 ）溶液 + 0.2ml H2O ，混匀（振荡），至少 30 秒后，再依次分别加入：0.4 ml 10 三氯乙酸（TCA ）溶液 + 0.4 ml 44 H3PO4溶液 + 0.4 ml 4 2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml3 FeCl3 溶液，混合后在 37水浴中保温60min ，测定 OD525 处的值。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）2.8 谷胱甘肽的测定：4g 新鲜材料 + 2ml 0

21、.3mol/L 醋酸汞+ 2ml 30 醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min ，使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次 10ml ）在摇动情况下冲洗2 次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min 后加入 1ml 20 的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的 100ml 玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml 水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml 淀粉液，用 1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。 1ml 1 mmol/L 的 KIO3 相当于0.

22、307mg 谷胱甘肽。（参考现代植物生理学实验指南，中国科学院上海植物生理研究所编）。2.9 天冬酰胺合成酶（ AS ）的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶（AspAT ）的测定：3 硝酸还原酶 (NR) 的测定采用离体法： （ 1g 样）（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ,P27 29）亚硝酸钠标准溶液（1g/ml ）：称 NaNO2 0.9857g , 定容到 1000ml ，再吸 5ml 定容到 1000ml 。0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液： 30.0905g Na2HPO4 12H2O + 2.4965g NaH2PO4 2H2O，加蒸馏水定容到 1000ml 。3mol/L HCl ： 125ml 浓盐酸加蒸馏水定容到500ml 。1 磺胺溶液： 5.0g 磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。0.2 a-萘胺溶液： 1.0g a-萘胺溶于125ml 冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml ，贮于棕色瓶中。0.1mol/L KNO3溶液： 5.055g KNO3 溶于 500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲