神经解剖学课件：神经解剖学

1、神经解剖学的研究方法,神经元,Brainbow,一. 传统神经解剖学研究方法,19世纪，神经解剖学逐渐成为一门独立的科学。 将化学染料技术引入神经组织染色： Remank-无髓神经纤维 Forel和Gudden-切片机 Broca-大脑皮质语言区 Luys-丘脑底核 等等科学家在此方面的贡献！,Golgi染色法 Cajal染色法 Nissl染色法 Weigert染色法和Marchi染色法 Glees-Bielschowsky染色法、Nauta染色法和Fink-Heimer染色法,Golgi染色法,Camello Golgi 意大利人，1873年创建了硝酸银镀染神经元的Golgi染色法。 染出的

2、神经元较少，但可以看到完整的轮廓和突起走向。在核团的内在组合，轴突和树突的走向等方面，为最经典和有效的形态研究方法。 1906年和Cajal共同获得诺贝尔生理或医学奖,Hito Golgi-Cox OptimStain Kit,缺点： 不确定、不稳定、不易掌握； 难分辨轴突，只有约5%神经元被染色； 染色机制及哪些类型的神经元被染出等等尚不清楚。 近年来 有人将单细胞内注射辣根过氧化物酶（HRP） 、Biocytin或荧光素（如lucifer yellow）和病毒进行逆行标记等方法称之为新Golgi染色法,Cajal染色法,1887年，Ramon y. Cajal看到了 Golgi染色法和We

3、igert-Pal染色法的标本 1903年，Cajal将照相技术引入 神经组织的染色。 神经原纤维-显示轴突末梢与其他神经元胞体之间的联系。,Neurofibril,Neurofilaments (NF) bundle together and form NF. When stained with silver, they are visible under the LM.,优点： 可以清楚显示胞体和轴突 可以追踪观察神经纤维的分布和投射状况； 缺点： 无法显示树突全貌。,Cajal的著作 人和脊椎动物的神经系统组织学及神经系统的变性和再生 Golgi倡导的网状学说和Cajal代表的神经元学说

4、 网状学说-神经元通过纤维束的联络形成整体的网，借此对周围组织传入的信息起着积累的作用 神经元学说-神经元之间的联络是不连续的，而是接触的，接触面上有颗粒状的黏合物质乃至特殊的传递物质。,Nissl染色法,1892年，Franz Nissl创立了Nissl染色法，并发现了Nissl体和Nissl变性等。 细胞构筑学-中枢神经的分区和分层 Campbell 、Brodmann 、Vogt等对大脑皮质的分区，Rexed对脊髓灰质的分层,Nissl body,LM: basophilic granules in perikaryon,EM: rough endoplasmic reticulum &

5、 free ribosomes,IHC DAB + Nissl counter,Tyrosine Hydroxylase，酪氨酸羟化酶,优点： 对神经元胞体染色，是研究CNS灰质构筑的好方法； 通过观察染质溶解，可以进行束路追踪； 缺点： 不能显示神经元全貌。,Weigert染色和Marchi染色,1884年，Karl Weigert发表了Weigert染色法，用于髓鞘染色。 1890年，Vittario Marchi发表了Marchi染色法，用于变性有髓神经纤维的追踪。 束路追踪研究,Weigert染色：金属化合物媒染后苏木精染色，显示神经组织特别是髓鞘，是显示髓鞘的优良方法。 Marchi

6、染色：可选择性的镀染变性髓鞘，广泛用于变性有髓神经纤维束的追踪。但对无髓神经纤维及细小的有髓神经纤维或薄髓纤维不适用。,Weigert staining,Marchi staining （osmium-basedstaining method),This cross section of the lower medulla is stained with the Marchi method, which selectively stains degenerated myelinated tracts black.,Glees-Bielschowsky染色法、Nauta染色法和Fink-Heim

7、er染色法,束路追踪-无髓神经纤维和细小的神经纤维不适用、以及轴突终末的位置不能确定-需要新的方法。 Glees-Bielschowsky染色法：可靠地染出变性的神经终末（AD病人，神经纤维纠缠）； Nauta染色法：高锰酸钾降低还原力并抑制正常纤维嗜银性，从而显示变性纤维靠近终末部分的变性像； Fink-Hermer染色法：硝酸铀染色，现在使用最为广泛。,二. 神经束路追踪法,轴浆运输追踪法 变性神经束路追踪法,（一） 轴浆运输追踪法-轴浆运输,Axonal transport system: Anterograde transport： Slow transport system (0.1

8、-0.4mm per day) Fast anterograde transport (100-400mm per day) Retrograde transport： Fast retrograde transport,追踪的基本方式 顺行标记 逆行标记 跨节标记,轴浆运输追踪常用方法 HRP追踪法 放射自显影神经束路追踪法 PHA-L顺行轴突追踪法 生物素葡聚糖胺顺行轴突追踪法 霍乱毒素B亚单位追踪法 荧光素追踪法 其他特殊荧光素追踪法 病毒追踪法,1） HRP追踪法,HRP：辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP)，是由一个分子的五色酶蛋白和一个分子的棕色

9、铁卟啉辅基结合形成的结合酶，分子量越40kDa，为同工酶的混合物，其中有A1，A2，A3，B，C，D，E七种，但仅B和C的逆行运输效果较好。,HRP追踪法的原理： Kristenson等(1971年)及LaVail等(1972年)创造了HRP追踪技术，最初只是用于逆行追踪。 注射HRP于末梢-非特异性整体胞饮摄入-逆向运输至胞体-组织化学显示HRP 例如：周围感觉末梢逆向标记、背根神经节跨节标记、眼球内注射后在CNS内跨突触标记等等,其他的结合型HRP：与一些受体结合 麦芽凝集素（WGAHRP） 霍乱毒素（CTHRP） 结合型的HRP灵敏度高、用量少，而且HRP在胞内降解时间延长，可以清晰显示

10、包括细微分支在内的整个神经元的全貌。 这些也可混合使用,向中枢核团导入HRP的方法 压力注射：直接缓慢注射，减少沿针道扩散。 电泳：HRP溶于电解质，间断通电，HRP溶液接阳极，动物接阴极。HRP会泳入而且无液体渗出，不会形成液体压力损伤组织。,向周围神经系统导入HRP的方法 器官内或神经干内直接注射，可定位支配某器官的运动或传递其感觉信息的神经元胞体位置，还可通过跨节标记来追踪感觉神经元的中枢投射部位。,HRP运送的速度： HRP被摄入的过程很快，但到达预定部位的时间取决与传输速度及距离。 顺行运输：300400mm/24h 逆行运输：一般认为只有顺行的一半，但也有人提出相差不大。 在标记部

11、位会集聚，到达胞体后会被马上送入溶酶体水解。,HRP法常用的固定： 戊二醛和多聚甲醛的弱碱性混合液 灌注加后固定，然后及时的冰冻或震荡切片 显色：切片后尽快进行 联苯胺和H2O2显色：低温或弱酸下蓝色，室温或碱性下棕色，可光镜和电镜观察 DAB和H2O2显色：棕色，可光镜和电镜观察，电镜较前一种方式好 TMB法：比DAB敏感，为深蓝色，非致癌性，但不稳定，易褪色，在pH7溶液中很快消失，可用重金属盐使之稳定，微细结构不如DAB。,与以往镀银法相比 注射区小，容易控制且不易损伤周围组织 HRP被摄取后，为一种外源性成分随轴浆运输，不会扩散或污染临近结构,HRP追踪法与其他技术的结合应用 1.与免

12、疫组织化学：既显示具体的纤维联系，又可显示其他如神经元内蛋白分布等等 2.与顺行追踪技术结合：用于研究两级以上的神经元构成的纤维联系，特别便于电镜观察 3.与荧光素逆行追踪技术结合：观察神经元轴突的分支投射,分析HRP结果时的注意事项： 有效注射范围：HRP从注射中心向周围扩散浓度递减，一般认为中心深染而不能辨明其结构的区域为有效区。 过路纤维问题：路经的纤维也可摄取并被顺、逆向运输，但一般这种标记比较弱，且其顺行标记的距离短。 分支标记：HRP在逆向运输过程中，也会被顺向运输到其他分支末梢。 跨突触标记：HRP被运至末梢后，可以被突触释放并被摄取到下一级的神经元甚至于再运入下一级的神经末梢，

13、常见于WGA-HRP法。需要反向追踪，验证结果。,2） 放射自显影神经束路追踪（ARNT）,放射自显影技术（autoradiography, ARG) 1972年，Cowan等将ARNT用于追踪 优点：灵敏，不标记过路纤维。,原理： 神经元选择摄取氨基酸，并在胞体合成蛋白质，然后被运至不同部位。将特定氨基酸用同位素标记，就可进行追踪。 主要用于顺行追踪,3） PHA-L顺行轴突追踪法,由L亚单位构成的菜豆凝集素(PHA-L) 1984年由Gerfen及Sawchenko提出 优点：显示的神经纤维末梢形态非常细致，且基本上无过路纤维标记问题,PHA-L可电泳导入 运输速度46mm/d，较慢，但电

14、泳后动物存活时间长(13周)，而且可在脑内维持45周不降解，可用于长的神经束路追踪 可与ARNT或HRP等方法结合使用,4）生物素葡聚糖胺顺行轴突追踪,利用肠系膜明串珠菌产生的葡聚糖，与不同的标记物结合形成 生物素葡聚糖胺(BDA)为代表 可用于顺行和逆行，但顺行较好 与ABC法中的生物素(biotin)一样，可与卵白素(avidin)强力结合，然后通过avidin上结合的HRP或荧光素来显色 可较好与其他逆行追踪技术结合，还可再结合免疫组织化学。,优点： 1. 动物存活2天2周，程序较PHA-L简单，灵敏度高，能充分显示轴突的分支及终末，且显示较为细致，能光镜和电镜使用。 2. 无损和损伤的

15、纤维均可。 3. 生物素不会引起细胞内的生理变化，因此特别适用于脑片和膜片钳的细胞内标记。 4. 可标记树突棘、轴突侧支等，而且可通过突触间隙，跨神经元运输。,5） 霍乱毒素B亚单位追踪法,霍乱毒素的B单位（CTb）无毒性，为受体结合单位。是一种灵敏的顺行、逆行和跨节标记的追踪剂。 与PHA-L步骤基本相似，可电泳和压力注射导入核团，分解慢，术后动物存活37天 可以与免疫组织化学方法结合，特别使用荧光素二抗时，CTb具有几乎所有荧光追踪剂的性能。 有与FITC和Rhodamine结合形式的追踪剂。,6）荧光素追踪法,1977年，Kuypers及同事发现荧光素（fluorescent subst

16、ance）可被神经末梢摄取并轴浆逆向运输 荧光素在一定激发波长的光照下，能以一定发射波长发出一定颜色的荧光，每一种都有各自的激发波长和发射波长，发射波长决定发出的颜色。,一般用于逆行追踪，有些特殊的可用于顺行。 多数标记胞质，少数仅标记细胞核，如nuclear yellow、diamidino yellow等 可在脑内进行2种或3种标记。,7）其他特殊荧光素追踪剂,亲脂碳花菁染料：可标记活细胞和固定组织细胞，可用于细胞膜结构和动态变化的研究。活薄片培养时，可在实时动态显微录像术下观察轴突的发育等。 荧光素葡聚糖胺类追踪剂：如TMR-DA。 荧光微球类追踪剂：不同颜色的荧光素标记聚苯乙烯或乳胶微

17、球制成。对组织无损伤，无毒性，光照耐受好，时间长(至少2年以上）等。,8）病毒追踪法,以神经营养性病毒为主，如单纯疱疹病毒、假狂犬病毒、腺病毒、禽病毒、弹状病毒等等。 病毒追踪可逆行从一个核团到另一个核团，可在神经元中增值，在一定时间后可以强标记。 近年有新型的将绿色荧光蛋白(GFP)重组到病毒中制作的基因重组病毒,局限性： 浓度依耐性，对神经元的毒性并导致神经元死亡。 星形胶质细胞和巨噬细胞会吞噬死亡的感染细胞，并在标记神经元周围聚集，限制病毒扩散。 需要预防和避免感染。,（二）变性神经束路追踪,当神经元的轴突被损伤后，在损伤轴突的近侧端和远侧端分别发生逆行溃变和顺行溃变，甚至跨神经元溃变。

18、 手段有物理损伤和化学损伤 化学常见如：6-羟基多巴胺、6-羟多巴和木胺对儿茶酚胺能神经元；5-羟色胺、氯苯丙胺对5-HT能神经元；AF64A或ECMA对胆碱能神经元；红枣氨酸和鹅膏蕈氨酸等对兴奋性氨基酸类神经元等等。,三. 化学神经解剖学,酶组织化学和荧光组织化学 免疫组织化学 免疫电镜技术 原位杂交组织化学法 受体及转运体定位法 神经系统功能活动形态定位法 激光扫描共聚焦显微镜技术,（一）酶组织化学法和荧光组织化学法,利用酶对底物的催化作用使底物发生颜色变化，借此对该酶进行定位、定量分析。过程中需注意保存形态和保持酶活性。 常见有： 乙酰胆碱酯酶组织化学法 NADPH法 单胺类物质的荧光组

19、织化学法,乙酰胆碱酯酶组织化学法,AChE是乙酰胆碱的分解酶，分布于神经元和肌组织等 原理：AChE分解底物，然后还原重金属盐捕获剂形成有色沉淀。 具体方法较多，但从抗胆碱乙酰基转移酶(ChAT)抗体出现后，此方法已较少见,NADPH法,一氧化氮酶(NOS)能催化精氨酸产生NO，NOS就是硫辛酸脱氢酶，且活性依赖于还原型辅酶II（NADPH）。 原理：硫辛酸脱氢酶氧化底物，从底物将氢传递给NADPH，通过NADPH使受氢体硝基四氮唑蓝（NBT）还原为formazan，形成蓝色沉淀，以此确定硫辛酸脱氢酶的位置并间接的反映NO的分布。,单胺类物质的荧光组织化学方法,1962年，Falck-Hill

20、arp法，用甲醛诱发神经组织内的单胺类物质发出荧光，在显微镜下观察。 儿茶酚胺类物质发绿色荧光，5-羟色胺发黄色荧光。 1972年，用乙醛酸诱发，提高了灵敏度 研究了这两类神经元的分布情况。,（二）免疫组织(细胞)化学,是利用免疫学上抗体与抗原结合的原理以及组织化学技术来对组织、细胞特定的抗原或抗体进行定位和定量研究的技术。 抗原通常是肽和蛋白，有数量不等的抗原决定簇。 有含有针对不同决定簇的多克隆抗体的血清 有杂交瘤技术制成的针对单个决定簇的单克隆抗体 抗体只识别抗原决定簇，因此需要注意抗体特异性和交叉反应,常见方法： 免疫荧光细胞化学染色法 免疫酶组织化学染色法 ABC法 其他免疫细胞化学

21、染色法 免疫组织化学双重染色技术,1. 免疫荧光细胞化学染色法,直接法：将荧光素直接标记在特异性的第一抗体上，然后抗体抗原结合。简单，需时短，特异性强，但灵敏度低，需标记每种抗体。 间接法：一抗与抗原结合，再用荧光素标记的第二抗体与第一抗体结合。较直接法灵敏，且经过二次甚至多次反应，标记强度增大，只需要标记一种抗IgG抗体即可。而且可以用ABC法进一步增强。,2. 免疫酶组织化学染色法,标记抗体的常用酶有：HRP和碱性磷酸酶等 1970年，过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法，为目前最常用的方法之一,PAP复合物: HRP的抗体和HRP结合形成的复合物，含有2个抗HRP的IgG分子和3个HRP

22、分子 三级抗体 二抗有2个Fab段，一个和一抗结合，一个和PAP复合物结合,二抗的Fab片段相同，因此一抗和PAP复合物中的抗过氧化物酶抗体需要来自同种动物。 HRP用底物来显色，常见如DAB和H2O2 显色后，可光镜和电镜观察 可用其他酶代替，如碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）,3. ABC法,ABC法与PAP法相似，也属于间接法，只是用ABC复合物代替PAP复合物 ABC复合物：卵白素(抗生物素)-生物素结合的HRP复合物，每一个卵白素可以结合4个生物素。,每一个卵白素上结合3个带HRP的生物素，并留出一个能与生物素结合的空位，因此可以使得复合物上结合大量的HRP，使得阳性结果非常明

23、显。,ABC复合物没有种属特异性问题，只需要二抗是针对一抗种属，而且时间较PAP短，灵敏度更高。,4. 其他免疫细胞化学染色法,蛋白A法：利用金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种抗原提取物A蛋白能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc片段结合而产生沉淀的特点。将HRP或者胶体金粒子与蛋白A交联。再将金粒子进行银增感反应，可以在光镜和电镜下观察。胶体金一般多用于电镜。 纳米金颗粒交联二抗：与胶体金同样原理，但颗粒直径小，易随二抗穿过细胞膜，所以敏感性更好，定位更准确，常用于电镜。,5. 免疫组织化学双重染色技术,相邻切片法：相邻两张连续切片，用不同抗体染色。 不同颜色呈色的双标法：切片第一种抗体孵育，PAP

24、法或ABC法反应在重金属盐（钴、镍等）存在情况下DAB和H2O2呈色，呈黑色或蓝黑色，再用其他抗体孵育，再PAP法或ABC法，然后单纯DAB和H2O2呈色，呈棕色产物。,免疫荧光组织化学双标法：来自不同种属动物的一抗孵育，然后用不同荧光素标记的二抗混合孵育，再在显微镜下通过更换滤色片来观察，现在甚至可以多重标记然后共聚焦显微镜观察。,6. 秋水仙素对免疫组化结果的影响,秋水仙素可以破坏微管结构，阻止轴浆运输，使神经元内合成的物质在胞浆中集聚，使得胞体染色更清楚。 可以侧脑室、脊髓蛛网膜下腔、体外培养液中给药。,抗体稀释和效价,稀释浓度称为抗体工作滴度。 效价越高，抗体质量越好。 不同实验，稀释

25、浓度不同（WB，IF，IHC等） 抗体不要反复冻融，配制的抗体工作液保存在4度等等,非特异性染色及消除的方法,内源性过氧化物酶：红细胞和中性粒细胞、固定较差的胶质细胞等。组织的固定和良好的清洗很重要，可用甲醇-H2O2封闭。 第一抗体：制备抗体使用的抗原纯度不高，导致产生的非特异性抗体。抗体需要尽量高倍稀释、PBS充分冲洗、正常血清封闭等。 第二抗体：IgG从血清分离时存在的，处理方法与一抗相同。,植物凝集素：主要来源于神经胶质细胞，多发在ABC法染色过程中。可以使用2-甲基-D-甘露糖苷饱和生物素。 自发荧光：组织自发荧光，多见于老年动物的组织，可用硼氢化钠处理10min，但可能影响组织的抗

26、原性。,免疫组化的对照试验,阳性对照 阴性对照 自身对照 吸收实验,（三）免疫电镜技术,包埋前染色： 抗体孵育不能加表面活性物质，常用冻融法增加抗体的通透性，再PAP或ABC法或纳米金等等方法染色。然后再进行包埋。优点是抗原性保存较好。 包埋后染色：在超薄切片后，在切片上进行免疫化学染色，不存在通透性和通过细胞膜的问题，但需要先H2O2处理，使表面树脂软化，利于抗体进入。,（四）原位杂交组织化学,1969年，原位杂交组织化学（ISHH） 主要用于显示神经元内的mRNA，现在灵敏度较高，可以显示细胞内仅几个拷贝的mRNA。 是用标记的单链核酸探针和组织中的mRNA反应，有cDNA探针、RNA探针、寡核苷探针，形成DNA-RNA或RNA-