分子生物学课件：7基因诊断

1、Gene Diagnosis 基因诊断,1,2,DNA-based methods do not replace haematological and biochemical investigations,形态学,家族史,血常规 （MCV,MCH）,生化检测,基因检测,3,/,/gtr/,4,Gene Diagnosis 基因诊断- 指利用分子生物学技术，检测体内DNA或RNA在结构或表达水平上的变化，从而对疾病做出诊断的方法，通常又称为分子诊断(Molecular Diagnosis)。,5,Landmarks

2、 Developments in Genetics and Molecular Diagnostics,Edwin Mellor Southern,Frederick Sanger,Yuet Wai Kan,Hamilton Smith,Watson and Crick,Avery,Morgan,Mendel,6,/yuet.kan,The Father of Gene Diagnosis,简悦威,7,8,Genes and Disease,Monogenic Disorder; Chromosomal Disorder; Multiple gen

3、e disorder; Mitochondrial Disorder,9,10,Principles of Molecular Biology,11,DNA methylation,Histone modification,12,RNA Families,lncRNA,13,14,15,J Mol Biomark Diagn 2:119.,16,Front. Genet., 20 April 2012 |,17,(a) Selected examples of RNA base methylation. (b) A group of dioxygenases that use iron, -k

4、etoglutarate and dioxygen to perform oxidation of modified RNA bases for demethylation or hypermodification.,18,Nature Chemical Biology. 2010, 6, 863865.,19,The human protein interaction network,20,Protein Modification,21,Molecular Biomarkers in Molecular Diagnostics,DNA RNA PROTEINS Metabolic subst

5、rates,Biomarker is a measurable indicator of the severity or presence of some disease state. More generally a biomarker is anything that can be used as an indicator of a particular disease state or some other physiological state of an organism.,Molecular biomarkers have been defined as biomarkers th

6、at can be discovered using basic and acceptable platforms such as genomics and proteomics.,22,DNA mutations,23,DNA polymorphisms-RFLP,24,DNA polymorphisms-VNTR,25,DNA polymorphisms-VNTR,26,DNA polymorphisms-SNP,27,28,Chromosomal Abnormalities,29,Circulating RNAs,30,Strategies for Gene Diagnosis 基因诊断

7、的策略 1. 直接诊断：直接检测突变 2. 间接诊断：连锁分析 （Linkage Analysis）,31,ATP7B,D13S313,D13S314,D13S316,Paternal,Maternal,Aa,Aa,D13S313,P,M,Son,Fetus,1,2,3,4,32,基因产物水平诊断,举例： 1. 654地中海贫血 2. BCR-ABL融合基因,33,基因诊断的技术,染色体水平 大片段缺失 重复 基因倒位 基因融合 小片段缺失 重复 点突变 碱基修饰,34,核酸分子杂交,聚合酶链式反应 （PCR),基因芯片,基因测序,35,核酸分子杂交 （Nucleic acid hybridi

8、zation）,1. 来源不同的DNA（或RNA）片段，按照碱基互补关系形成异源双链分子的过程。 2. 探针（Probe）：带有某些标记物的特异性核酸序列片段 3. 来源：DNA，cDNA，人工合成的寡核苷酸片段 4. 基本方法：印迹杂交和点杂交,36,Southern印迹杂交,37,38,39,Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。 是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人改进。 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况。,Northern印迹杂交,40,Northern印迹杂交流程图,41,与So

9、uthern印迹杂交比较：,RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA 2-OH 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态,42,点杂交 正向：是将待检样（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定 反向：是将探针固定,点杂交（Dot-Blot）,点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。 特别适合做点突变,43,反向点杂交（Reverse Dot-Blot）,44,聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction, PCR）,在D

10、NA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性退火延伸三个基本反应步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。,45,PCR 循环- 第一步 加热变性,46,PCR 循环- 第二步 引物与模板DNA分子退火,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,47,PCR 循环- 第三步 - 引物延伸,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,48,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,49,30次循环后靶序列扩增的数量,循环数 扩增产物量 （2n） 1212 2224

11、 3238 42416 52532 62664 202201,048,576 302301,073,741,824,50,PCR原理示意图,51,PCR的基本原理,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,52,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,53,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,54,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,55,PCR的基本原理,PC

12、R反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,56,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,57,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,58,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,59,在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。 如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需24min， 23h就能将待扩目的基因扩

13、增放大几百万倍。,60,实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 在PCR反应体系中，Real-time PCR的荧光标记物可分为两种：荧光染料标记和荧光探针标记。,61,1. 荧光染料法,SYBR荧光染料 (SYBR Green based Quantitative PCR) 能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异

14、性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。,62,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,63,SYBR-Green I荧光染料原理示意图,64,Taqman技术 （TaqMan probe）,2. 荧光探针法,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher,

15、 Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,65,TaqMan技术原理示意图,66,DNA Microarray,DNA芯片技术,67,DNA Microarray,DNA芯片技术,68,69,荧光原位杂交 Fluorescence in situ hybridization,70,71,比较基因组杂交 Comparative genomic hybridization（CGH）,72,Schematic of CGH protocol,73,Array comparative genomic hybridiza

16、tion,74,Array-CGH protocol,75,多重探针连接扩增 Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA),76,77,单链构象多态性 Single Strand Conformation polymorphism（SSCP）,78,变性高效色谱分析 Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC),79,DNA sequencing,第一代：双脱氧核苷酸末端终止法,80,81,第二代：焦磷酸测序（Pyrosequencing）,DNA seque

17、ncing,82,DNA sequencing,第三代：单分子实时测序 （Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT),The DNA sequencing is done on a chip that contains many ZMWs (Zero-mode waveguide),Inside each ZMW, a single active DNA polymerase with a single molecule of single stranded DNA template is immobilized to the bottom,The

18、 signal from a phospho-linked nucleotide incorporated by the DNA polymerase is detected as the DNA synthesis proceeds which results in the DNA sequencing in real time,Developed by Pacific Biosciences,15-minute, $100 human genome sequencing,83,开展个体化诊断与治疗依赖于基因/基因组序列 第一代测序技术：双脱氧核苷酸末端终止测序法 一个测序反应可读有效长度：

19、500bp 1000bp（1Kb） 完成一个人基因组测序：3000000Kb（3000Mb） 费用：20元3000000 6000万元 第二代测序技术：焦磷酸测序技术（高通量） Roche 454，运行1次可测 1000000Kb/1万美元（3万美元） Illmina，运行1次可测 2个人的基因组（3万美元），8 day 第三代测序技术（纳米、单分子、实时） 费用：30亿美元 3010万美元？ 1000美元100美元 测序时间： 15年 6周 1周 ？ 60分 15分,84,0 反转录PCR（RT-PCR）,85,基因诊断的实例,杜氏肌营养不良 （Duchenne muscul

20、ar dystrophy ） -Deletion； Multiplex PCR/MLPA 2. 镰状细胞贫血 （Sickle cell anemia） -Point mutation； Southern Blot/PCR-RFLP 3. 654地中海贫血 （ 654 thalassemia） -Aberrant Splicing; RT-PCR 4. 血友病A （Hemophilia A） -Linkage analysis 5. 脆性X综合征 （Fragile X syndrome） -Trinucleotide repeat； Southern Blot,86,杜氏肌营养不良 （Duche

21、nne muscular dystrophy ）,Xp21.2-p21.1,87,88,89,镰状细胞贫血 （Sickle cell anemia）,ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA,ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGT

22、TGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA,90,Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Southern Blot,91,300bp,200bp,500bp,92,PCR-ASO (allele-specific oligonucleotide),93,反向点杂交（Reverse Dot-Blot）,94,RT-PCR,654地中海贫血 （654 thalassemia）,95,血友病A （Hemophilia A, HA）,99bp,43bp,142bp,Bcl I,Bcl I,142bp,96,血友病A

23、 （Hemophilia A, HA）,97,遗传病的诊断时机,1.症状前诊断（Asymptomatic diagnosis） 2.产前诊断 （Prenatal diagnosis） 3.着床前诊断 （Preimplantation diagnosis）,98,产前诊断 Prenatal Diagnosis,遗传学检查 细胞培养、染色体检查、分子诊断等 生化检查 特殊蛋白质、酶、代谢底物、中间产物和终产物等 物理诊断 B超、X线、胎儿镜、电子监护等,99,羊膜穿刺 妊娠16-20周,绒毛取样 妊娠9-12周,invasive prenatal diagnosis,100,Other sourc

24、es of fetal tissue for PND,Difficult to isolate and persist for years after pregnancy,Fetal cells in maternal circulation erythroblasts trophoblastic cells leucocytes,Cell free fetal DNA in the maternal circulation,Detectable from 5 weeks Cleared from circulation within 30 minutes of delivery 3 6% o

25、f total circulating cell free DNA Originates from trophoblast,101,102,Quantification and normal ranges,103,104,着床前诊断 （Preimplantation diagnosis）,105,106,107,感染性疾病的基因诊断的临床应用及评价,弥补血清学检测技术的缺陷 检测不能培养或生长缓慢的病原微生物 通过病原体的定量检测监测疾病 微生物耐药性的检测 细菌分型及流行病学的调查,108,肝炎病毒基因的检测,临床价值主要体现在： 病情评估 血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载

26、量越高，肝组织炎症反应程度越重。 疗效预测 治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。,109,预后判断 病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。 垂直传播途径感染者，预后较差。 反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸 水平经常波动者更易发展为肝硬化。,110,病毒分型和耐药检测 各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致 HBV感染的不同血清学和临床表现。 检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。,111,1.诊断策略,一般性检出策略 通过探针或扩增技术直接检出病原微生物的DNA/RNA，判断

27、有无感染或何种感染。 完整检出策略 思路：诊断分型亚型耐药性检测,112,2. 常用的诊断方法,信号放大检测技术方法 不涉及靶分子扩增，采用多酶、多探针或二者结合等方式增加探针标记物的浓度从而使信号得到放大，提高检测的灵敏度。如：液相杂交、杂交捕获及支链DNA（bDNA）等。 特点 美国FDA批准的商业试剂盒 感染因素少，无扩增所产生的污染 稳定性、重复性和特异性都较高，结果准确 放大倍数少，灵敏度较低,113,2. 常用的诊断方法,靶分子扩增技术检测方法 即方法中包含靶分子（DNA、RNA或探针）的扩增过程的技术。如PCR及衍生的扩增技术、连接酶链反应（LCR）、链替代的扩增方法（SDA）、

28、转录依赖扩增系统（TAS）、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA） 特点 我国所售的商业试剂盒 简便、快速、灵敏度高 存在扩增所带来的污染问题,114,3. 诊断标本的处理,标本的选择 标本量及抗凝剂 标本的传送、保存 标本的预处理,115,3. 诊断标本的处理,标本的选择 与传统一样，标本的选择要符合疾病的发病机制，能反映病程的状态。 由于检测方法的高灵敏性，可适当考虑标本采集的便利性和通用性。 由于核酸样本的稳定性，可选用福尔马林及石蜡包埋固定的组织标本。 核酸的选择对疾病的判断也很重要。什么时候用DNA？什么时候用mRNA?,116,3. 诊断标本的处理,标本量及抗凝剂 少量标本：100u

29、l-500ul不等，至多1ml； 不同的检测方法，所需的标本量不一样； 抗凝剂：EDTA、柠檬酸、草酸盐、肝素； 肝素对转录酶和聚合酶有抑制作用，因此，基于PCR的检测方法一般不用肝素抗凝。,117,3. 诊断标本的处理,标本的传送、保存 根据标本的种类和检测目的，建立合理的运送体系。 保证核酸完整性，防止标本相互间的交叉污染。,118,3. 诊断标本的处理,标本的预处理 核酸的提取(DNA提取、 RNA提取) 扩增抑制物的去除 危险病原体的灭活,119,4. 诊断结果的解释,阴性结果： 阳性结果： 定性检测结果： 疾病状况的判断：,解释应包括病原体的生物学、病理学特征、实验技术的优点及局限性

30、。,120,4. 诊断结果的解释,阴性结果解释 检查质控是否正常。 检查检测灵敏度、核酸提取量及扩增效率是否正常。 引起假阴性的因素：样品量不足、标本类型不恰当、收集时间不符合要求、运输过程中样本降解。,121,4. 诊断结果的解释,阳性结果解释 检测质控是否正常。 注意检测的特异性和可能受到的污染等情况。 产生假阳性的因素：引物探针的特异性、样本在采集、运送和处理等不同环节中的交叉污染问题。,122,4. 诊断结果的解释,定性检测结果解释 考虑定性检测的局限性 考虑特定情况下，核酸样本的稳定性和不易降解性。,123,4. 诊断结果的解释,疾病状况的判断 病原体存在与患病之间的相关关系 为正确

31、判断疾病应：选择具有代表性的标本，采用具有说服力的检测方法，建立适量的临界值。,124,SARS相关冠状病毒的分子诊断,2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。 一种新的冠状病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365),125,2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获得一段长度为300bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。 .org on April 10, 2003）,126,127,检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。 检测方法 1.逆转录-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2.逆转录-实时PCR (Reverse-Real time PCR),128,129,有报道显示，在可能SARS病人