3-3胚胎工程的应用及前景

1、,试管动物技术,是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。,二、体外受精和胚胎体外培养,体外受精,概念：采取雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使其在试管受精。,过程： （1）精子的收集和获能； （2）卵母细胞的收集和培养； （3）获能精子和卵细胞的受精。,“试管动物”,超排卵技术,利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵。,在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。,体外受精,胚胎体外培养,概念：将受精卵在人工环境下培养成早期胚胎。 培养液：（不同时期成分不同） 水、无机盐、有机物、维生

2、素、激素、氨基酸、核苷酸以及动物血清等。,胚胎培养比组织、细胞培养要难。,其他方式,3.3 胚胎工程的应用及前景,胚胎工程技术： 胚胎移植 体外受精 胚胎分割 胚胎干细胞培养 目前应用较多的是： 胚胎移植、胚胎分割、体外生产胚胎技术。,英国人W希普于1890年在剑桥大学将纯种安哥拉兔的早期胚胎移植到一只已和同种交配、毛色特征完全不同的比利时兔的输卵管内。结果生出4只比利时仔兔和2只由胚胎发育而成的安哥拉仔兔。 这是世界上第一例胚胎移植，胚胎移植技术由此创始。,比利时兔,安哥拉兔,如何利用普通的比利时兔，快速地获得大量的具有性状优良的安哥拉兔呢？,一、胚胎移植,（一）概念: 将雌性动物的 ，或者

3、通过其他方式得到的胚胎，移植到 的、 的其他雌性动物的体内，使之发育为新个体的技术。,同种,生理状态相同,早期胚胎,实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的 受体分工合作共同繁殖后代的技术。,胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序,（二）胚胎的来源： 雌性动物的早期胚胎； 体外受精及其他方式得到的胚胎； 体细胞核移植及培养获得； 转基因技术获得。 供体：提供胚胎的个体。 受体：接受胚胎的个体。 受体的要求：同种、生理状态相同。,（三）供体和受体的选择供体:育种价值高、生殖机能强、体质强健受体:繁殖能力较强的健康本地品种,供受体模式引进牛&地方黄牛,胚胎移植的优势,可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力

4、 供体的主要职能： 只产生具有优良遗传特性的胚胎 受体的职能： 担任繁重而漫长的妊娠和育仔的任务,加速育种工作和品种改良； 大量节省购买种畜的费用； 一胎多产； 保存品种资源和濒危物种； 可充分发挥优秀个体的繁殖潜能缩短繁殖周期，增加一生繁殖的后代数量。,胚胎移植的意义：,胚胎质量鉴定 正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。,利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。,人工受精 激素注射结束后，观察到发情后小时，开始第一次输精，时隔小时进行第二次输精

5、，输精量是常规量的两倍 。,选择,供体母羊,受体母羊,同期发情处理*,超数排卵*,供体公羊,配种,取出早期胚胎,质量检查、培养,胚胎移植,妊娠检查,分娩（胚胎移植的犊羊）,未配种,同期发情技术： 主要是借助外源激素剌激卵巢，使其按照预定的要求发生变化，使处理母畜的卵巢生理机能都处于相同阶段，从而达到同期发情。,（四）胚胎移植的基本程序：（以波尔山羊为例）,模式之一波尔羊&奶山羊,胚胎移植的技术程序,供体和受体的选择,模式之二杜泊羊&地方绵羊,羊同期发情,供体超排处理：注射促性腺激素,供体配种,胚胎收集：冲卵,胚胎检查,胚胎检查,胚胎检查,胚胎移植或保存,胚胎移植,手术法移胚,1）手术移植 先将

6、受体母牛作好术前准备。已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎；未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口。,2）非手术移植 非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影响受胎率。在非手术移植中采用胚胎移植枪和025毫升细管移植的效果较好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。,非手术法移胚,受体产下犊子,为什么胚

7、胎移植能成功?,移动到任何一头动物子宫内都能发育吗? 同种动物发情排卵后,在一段时间内供体受体具有相同的生理环境。 为什么能收集到胚胎? 早期胚胎一定时间内处于游离状态。 供体和受体会不会发生排斥？ 同种动物之间基本上不排斥。 移植的胚胎能否保留供体双亲的特性? 胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但其遗传特性不受受体的影响。,.,.,（三）.胚胎移植的生理学基础,世界首例冷冻胚胎克隆水牛“盼盼”（左）与“代孕妈妈”在一起,盼盼”在植入娘胎之前，在实验罐度过了2个月的冷冻期。,胚胎冷冻技术的研究成功，可以长时间保存优良品种的遗传资源和濒危物种；突破了时间和地域的限制，便于胚胎运输，大量节省购买

8、种畜的费用。,二、胚胎分割,优势:可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。,概念:采用机械方法将早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。,特点： 后代具有相同的遗传物质，克隆 选择的胚胎： 发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚 使用的主要仪器： 实体显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针,理论基础 动物胚胎细胞的全能性。 所以胚胎分割的时期为：囊胚或桑椹胚。,操作注意事项： 对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割。 原因：内细胞团一般到囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割

9、，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。,操作注意事项： 胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低。 早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到；再者，细胞数目是有限的。分割的份数越多，不但难以做到均等分割，每一份的细胞数会越少，而且作为囊胚期的胚胎内细胞团细胞所受的影响会更大。因此，分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低。,胚胎分割的基本过程 胚胎移入培养液； 分割胚胎（机械法、酶处理）； 移植胚胎给受体； 着床产仔。,胚胎分割的基本操作,选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用

10、分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。,（1）显微针分割法 该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上作一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入2个预先准备好的空透明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。 （2）显微刀分割法 该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。,胚胎分割的方法,（3）酶软化透明带后显微分割法 用0.5%的链霉蛋白酶软化胚胎透明带, 若是紧密化胚胎(如桑椹胚) , 则需在无钙

11、、镁的平衡盐溶液中处理20 分钟, 使胚胎去紧密化，将胚胎固定，把将针置于欲分割的胚胎上面, 使其与胚胎呈30 度角, 对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。 （4）酶消化去透明带后分割法 用0.25%0.5%的链霉蛋白酶去掉胚胎透明带, 然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。,（5）徒手分割法 主要适用于分割体积较大的胚胎； 优势：可以不用显微操作仪。 操作：在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。该方法操作简便、快速，便于生产应用，

12、但要求要有较为灵巧的操作技能。,胚胎分割基本过程,代孕母牛,胚胎分割的基本过程,胚胎移入培养液,分割胚胎（机械法）,移植胚胎给受体,着床产仔,尽管胚胎分割技术已在多种动物包括人类取得成功，但是仍然存在很多问题须作深入研究。 （1）胚胎分割产生的后代初生体重低，在牛切割胚胎移植实践中发现，有些分割胚即使培养到囊胚阶段与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移植后代的体重也相应降低。这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但发育机理还有待深入研究。,胚胎分割目前存在的问题和发展前景,（2）遗传一致性问题，同一胚胎切割后获得的后代，在理论上，遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。人们发现67日龄牛胚胎分割后，

13、同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2-细胞阶段分割，却表现出遗传一致性。这种现象与胚胎细胞的分化有密切关系，但目前对不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力了解很少；,（3）最后还存在同卵多胎的局限性，从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。迄今，最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。因此，通过胚胎分割技术生产大量克隆动物目前难以取得进展。,目前，胚胎性别鉴定的准确率能够达到100%，胚胎分割后的存活率达80%以上。利用胚胎分割性别控制技术将比无性别控制繁育优良品种的数量和速度增加近一倍，从而可节省近一半的时间、精力和费用。这对于促进

14、优质高效畜牧业的发展将具有重要意义。,胚胎分割-性别控制技术意义?,练习,A,1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是（ ） A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植 B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态 C.超数排卵技术要使用一定的激素 D.试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行,B,2.下列对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是（ ） A.供体母牛必须是同一物种的良种 B.受体母牛必须是同一物种的良种 C.供体公牛必须是同一物种的良种 D.受体母牛可以是同一物种的一般健康牛,C,3.利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的重要原因是（ ） A.细胞分裂 B.细胞特化 C.细胞分化

15、 D.细胞增殖,2 .干细胞的增殖特点 缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化。 自稳性：会自我更新维持自身数目的恒定。,53,1.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。,MEDICAL CELL BIOLOGY,MEDICAL CELL BIOLOGY,54,在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能,全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞,按分化潜能,按发育状态(来源),胚胎干细胞 成体干细胞,三，干细胞的分类,全能干细胞 是指具有无限分化潜能,能分化成所有组织和器官的干细胞。换句话说,也就是具有形成完整个体分化潜能。,56,58,多能干细胞具有增殖

16、、分化两种功能。,Eg.骨髓造血干细胞 造血干细胞一般条件下处于休止状态，一定条件下能大量增殖、分化，然后由定向干细胞再分化成血液中至少12种类型的血细胞。,59,2.干细胞来源上分:,来源上讲，干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。,60,（二）成体干细胞,成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。,61,科学家鉴定或分离出多种成体组织的干细胞， 造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞。,主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。,62,造 血 干 细 胞,骨髓造血多能干细胞的分化,胚胎干细胞,1.概念：简称ES或EK细胞，是由早期胚胎(内细胞团）或原始性腺中分离出来的一类细

17、胞。一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。,经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。 可以分化成任何一种组织类型的细胞。,来源,a.取自终止妊娠的胎儿的性器官组织。,MEDICAL CELL BIOLOGY,MEDICAL CELL BIOLOGY,65,b.取自体外受精胚胎囊胚期内细胞团。,c.通过体细胞核转移技术获,MEDICAL CELL BIOLOGY,MEDICAL CELL BIOLOGY,2.特点: 1)形态：体积小、细胞核大、核仁明显。 2)功能：具有发育的全能性；可分化为成年动物体内任何一种组织细胞；体外培养可增殖不分化。 3）在体

18、外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。,胚胎干细胞培养,胚胎干细胞的培养,干细胞培养过程,加入抑制因子，抑制细胞分化。,饲养层细胞,胚胎干细胞的诱导分化：加分化诱导因子 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养 胚胎干细胞造血细胞 RA 胚胎干细胞神经细胞 DMSO 胚胎干细胞肌肉细胞 TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胎干细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素+T3 胚胎干细胞脂肪细胞 BMP-2, BMP-4 胚胎干细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油 胚胎干细胞骨细胞 基因转染 胚胎干细胞胰岛素分泌细胞,来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病：,细胞类型 治疗的疾病 神经细胞 中风、帕金森氏病、老年痴呆症、 脊髓损伤、多发性硬化病 心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病 产生胰岛素的细胞 糖尿病 软骨细胞 骨性关节炎 血细胞 免疫缺乏症、血液病、白血病 肝细胞肝炎、肝硬化 皮肤细胞烧伤 骨细胞骨质疏松症 视网(眼)细胞黄斑症 骨骼肌细胞 肌肉萎缩症,3.主要用途 (1)治疗人类的某些顽症 (2)培育出人造组织器官，用于器官移植 (3)是研究体外细胞分化的理想材料,干细胞治疗的特点：,1.一次性介入，永久性治疗； 2.不需要完全了解疾病发生的确切机理； 3.可应用于自身干细胞移植，避免产生