实验酶联免疫吸附测定.ppt

1、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）,免疫学教研室,基础医学院免疫学教研室,抗原-抗体反应的基本检测方法,凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。,沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。,补体参与的反应,免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。,基础医学院免疫学教研室,用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。,免疫标记技术,基础医学院免疫学教研

2、室,用FITC-抗IgM单抗计数B细胞,免 疫 荧 光 技 术,基础医学院免疫学教研室,课程内容,ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例,基础医学院免疫学教研室,酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA),酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELIS

3、A、竞争ELISA等,基础医学院免疫学教研室,ELISA的原理,1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记,E,基础医学院免疫学教研室,ELISA的分类,（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法,基础医学院免疫学教研室,直接ELISA,酶标一抗,基础医学院免疫学教研室,间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。,间接法（测抗体）,基础医学院免疫学教研室,夹心 （检测抗原）,只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于

4、包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,基础医学院免疫学教研室,竞争抑制法 （检测抗原） 待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,基础医学院免疫学教研室,标准HBcAg,wash,待检HBcAb,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；,基础医学院免疫学教研室,间接ELISA,实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中

5、抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸,基础医学院免疫学教研室,操作步骤,包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100l/孔，4过夜 封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200l/孔），37,20min 弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Twee

6、n20）洗板3次 加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（ 100l/孔），以200起始，空白对照孔用洗液代替， 37,20min 洗板3次 加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100l/孔）， 37,20min 洗板3次 显色：加入底物,100l/孔。室温避光显色5-10min; 2MH2SO4终止反应 结果判定,间接ELISA,基础医学院免疫学教研室,E,E,终止液终止显色,A,B两排同样操作，每孔加ul!,包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜,加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清， 37 15min,加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37

7、15min,洗涤：3次，1min/次,封闭：5%脱脂奶粉，37 20min,终止液50ul,空白对照无显色,加底物液显色,底物液100ul,洗涤：3次，1min/次,洗涤：3次，1min/次,基础医学院免疫学教研室,A,B排上样完全相同：复孔,2-12号每孔00uL稀释液， 号孔加入200uL一抗，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，号孔吸取uL，丢弃！ 每孔终体积100uL,无Ab, 仅稀释液,基础医学院免疫学教研室,病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等,临床疾病诊断中的应用,蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物,非肽类激素测定：T3

8、、T4，性激素测定, ,ELISA在医学中的应用,基础医学院免疫学教研室,ELISA在其他相关领域中的应用,科研服务,食品安全, ,环境卫生,基础医学院免疫学教研室,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。,酶催化底物液显色,E,基础医学院免疫学教研室,基础医学院免疫学教研室,结果的判定,肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。各组各人独立观察记录。 测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。,基础医学院免疫学教研室,结果的判定,空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅,待检样品孔显色明显,空白对照,基础医学院免疫学教研室,定量方法：标准曲线,待检样本,基础医学院免疫学教研室,注意事项,对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作