第25章 临床酶法的原理与方法.ppt

1、第二十五章临床酶法分析的原理与方法,第2页,教学目标与要求,掌握,临床酶法分析的概念，脱氢酶和过氧化物酶指示系统的应用原理。,熟悉,临床酶法分析的理论基础，酶循环法以及其它酶法分析的设计原理。,了解,临床酶法分析的发展前景。,第3页,主要内容,酶法分析方法的理论基础,酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法,脱氢酶指示系统测定的原理与方法,酶循环测定的原理与方法,酶激活与酶抑制测定的原理与方法,过氧化物酶指示系统测定的原理与方法,第4页,酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法。 临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代

2、谢产物的技术。,第一节 酶法分析方法的理论基础,第5页,酶法分析的优点,第6页,酶法分析根据检测类型可分为平衡法（终点法）和速率法（动力学法）。 根据方法设计的原理不同分为：酶反应前后光吸收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化物酶指示系统测定法、酶循环测定法和酶激活与酶抑制测定法等。,第7页,酶法分析,酶反应前后光吸收变化测定法,脱氢酶指示系统测定法,过氧化物酶指示系统测定法,酶循环测定法,酶激活与酶抑制测定法,第8页,平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定，即通常所说的终点，所以又称为终点法。,一、平衡法测定的理

3、论基础,第9页,将米氏方程改写为：,公式25-1,积分得：,第10页,当反应达到平衡，假设 ，即 S0St S0，则可简化为：,说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax和S0有关，Km越小、Vmax越大、S0越小则达到平衡所需的时间越短。,第11页,若 S0 Km，公式25-1式简化为：,积分得：,如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度，只要标准管与测定管的反应时间（t）一致，则有：,第12页,标准管的 S0St 与待测管的 S0St 分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu。,公式25-2,公式25-3,第

4、13页,速率法测定的是酶促反应的速度（通常是指初速度），其依据是，当底物的消耗量较小时（5%），酶促反应呈一级反应，此时的酶促反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。 当S Km，则S+ Km Km，当酶量固定不变时，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时, 酶促反应符合一级反应。,根据米氏方程：,二、速率法测定的理论基础,第14页,如同时检测标准管，则有：,公式25-4,标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu，速度用 A/min来表示。上式改写为：,公式25-5,第15页,公式25-5就是速率法测定代谢物浓度的原理，其前提条件是测定酶促反应的初速度。随着酶促反应的进行，S越来越小，v也

5、越来越小。,平衡法与速率法这两种方法是相互联系的，平衡法在开始的一段时间内有可能遵循一级反应规律。相反，速率法只要给予足够的时间也会趋于平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成为一级反应。,有些待测物本身在一定波长下就具有特异性的光吸收，但经过酶促反应以后生成的产物在相同的波长处则无特异性的光吸收。通过直接测定待测物或产物本身信号的改变即可进行定量，这种分析方法即是酶反应前后光吸收变化测定法。,第二节 酶反应前后光吸收变化测定的原理和方法,第17页,如尿酸在293 nm处有特异性的光吸收，但经过尿酸氧化酶（UAO）催化生成的尿囊素则在293 nm处

6、无特异性光吸收，可以通过尿酸在293 nm处的吸光度下降来计算尿酸的浓度。,第18页,胆红素在450 nm处有特异性的光吸收，经胆红素氧化酶（BOD）作用生成胆绿素，导致胆红素在450 nm处的吸光度下降，以此来测定胆红素的浓度。,第三节 脱氢酶指示系统测定的原理和方法,脱氢酶可以催化底物脱氢，脱氢酶催化的反应如下：,第20页,以脱氢酶为指示酶系统测定的是氧化型辅酶（NAD+）或氧化型辅酶（NADP+）在340 nm处的吸光度增加来计算待测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度。,第21页,有一些待测物

7、测定的时候不需要偶联另一个酶促反应，经一步反应后就可以完成氧化型辅酶和还原性辅酶之间的转换，称为单酶反应法。 由于该类反应通过辅酶在氧化型与还原型之间的转换进行，所以很容易用紫外吸收分光光度法测定340nm处吸光度的增减来进行定量。例如乳酸、丙酮酸的测定等。,一、单酶反应测定法,第22页,若酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，则应将反应生成的某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的，此类方法称酶偶联法。,二、酶偶联测定法,第23页,例如血清葡萄糖己糖激酶法（HK法）测定，在测定中，HK是辅助酶，G-6-PD为指示酶，指示酶反应将NAD+转化为NADH，340 nm吸光度增加的速度

8、即与葡萄糖的含量成正比。反应式如下：,第24页,血清尿素测定： 测定340 nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定，如果带标准品一起测定也可以用平衡法测定。,第25页,试剂成本低，反应速率快，灵敏度高,共同的问题就是容易受到内源性脱氢酶的干扰，此外，样本和试剂本身也会给测定带来影响,优点,缺点,第四节 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法,当待测物可以通过氧化酶的催化生成H2O2，然后用过氧化物酶（POD）指示终点，此即为过氧化物酶指示系统测定法。,代谢物在酶催化反应中如能够生成H2O2，则POD可催化H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚一起形成红色的醌类化合物，该化合

9、物最大吸收峰为500 nm，该反应即被称为Trinder反应，,第27页,待测物经过一步酶促氧化反应即能有为H2O2生成，这样的反应称之为一步反应。例如：血清葡萄糖氧化酶法测定。,一、一步反应测定法,第28页,待测物经过两步酶促反应才能被氧化为H2O2，这样的反应称之为两步反应。例如：血清总胆固醇氧化酶法测定。,二、两步反应测定法,第29页,待测物需要三步或三步以上的酶促反应才能被氧化为H2O2，这样的反应称之为多步反应。例如：血清三酰甘油的测定。,三、多步反应测定法,第30页,表25-1 常用的Trinder反应生色基团,第31页,1,2,缺点,催化该反应的POD对底物专一性差，标本中其它过

10、氧化物也可一起被转化，使测定结果偏高。,反应过程中可受到数十种还原性物质的干扰。,第32页,常采用双试剂剂型排除干扰。 应用抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶加入试剂中，可排除样本中维生素C和胆红素干扰。,第33页,第五节 酶循环测定的原理与方法,酶循环测定法是酶法分析的发展和延伸。酶循环测定法的关键技术是利用酶促反应中的酶在反应前后质和量都不改变的特性，只要有足够的底物，即可一直催化反应下去，底物靠其生成的非信号产物循环提供，使可测信号越来越大，提高了检测的灵敏度。,第34页,酶循环测定法利用底物和辅酶之间的循环反复反应，只需要有少量的底物和辅酶，就可使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循

11、环次数。反应产物增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和高特异性的要求。,第35页,产物循环-氧化酶-脱氢酶系统使用两种酶，即一种氧化酶作用后使底物发生氧化，氧化产物经一种脱氢酶催化其回到还原状态，促使底物和底物的氧化产物进入循环。在底物和产物循环的同时伴有H2O2的生成和NADH向NAD+的转变 （图25-1） 。,一、产物循环氧化酶脱氢酶系统,第36页,图25-1 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统,第37页,底物循环-脱氢酶-辅酶系统中底物（或衍生物）及其氧化产物进入循环，反应循环中有一种脱氢酶和两种辅酶：辅酶硫代氧化型辅酶（thio-NAD+）和还原性辅酶（NADH）。,

12、二、底物循环脱氢酶辅酶系统,第38页,该循环反应要求以下条件：酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力；溶液pH和缓冲体系同时有利于双向反应（底物氧化和还原）；thio-NAD+ 和NADH二者的浓度配比达最适条件。,图25-2 底物循环-脱氢酶-辅酶系统,第39页,氨循环-合成酶-脱氢酶系统是通过靶物质NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在的条件下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经亮氨酸脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340 nm测定（图25-3）。凡是代谢物在测定过程中有NH4+生成的都可以利用此法进行测定。,三、氨

13、循环-合成酶-脱氢酶系统,第40页,图25-3 氨循环-合成酶-脱氢酶系统,第41页,酶循环测定法的优点是：灵敏度可以随反应时间的延长而提高，并随酶在扩增反应中的用量而提高；利用酶对底物的特异性，使测定系统简化；利用四唑盐类的显色反应还可实现比色测定。因此，该法对体内极微量物质的测定是一种很有发展前景的方法。,第42页,第六节 酶激活与酶抑制测定的原理与方法,酶的另一特点是可调节性，它既可被某种物质激活，如金属离子等，也可被一些物质抑制，如氨茶碱等。据此，人们设计了酶激活与酶抑制测定法，用于人体生化物质的测定。,第43页,图25-4 激活剂与酶结合后恢复酶的催化活性,一、酶激活测定法,第44页

14、,异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子：,碱性磷酸酶法测定锌离子：,第45页,在检测的时候将待测物（抑制剂）加入反应体系，此时酶的活性被部分抑制，然后测定体系中剩余的酶的活性，通过被抑制的酶的活性即可以计算出标本中待测物的含量（图25-5）。,二、酶抑制测定法,第46页,图25-5 抑制剂与酶结合后抑制酶的催化活性,第47页,例如有机磷的酶法测定：有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37孵育10 min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，从被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量（图25-6）。,第48页,图25-6 有机磷抑制胆碱酯酶的活性,第49页,小 结,酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法。 代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 酶法分为平衡法和速率法。,第50页,平衡法是指标本中待测物经过酶促指示反应信号达到平衡，测定底物的总变化量。该法的关键是要确定达到平衡所需的时间。 速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。 在实际应用中速率法可用固定时间法代替，只要此期间待测物消耗 5%，则测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本