DB37T 3128.2-2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术

1、ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T 3128.22020群禽腺病毒感染诊断技术第2部分：血清4型群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术Diagnostic techniques for fowl adenovirus group IPart 2: Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局 发布DB37/T 3128.22020前言本标准按照GB/T

2、1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。9群禽腺病毒感染诊断技术第2部分：血清4型群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术1 范围本标准规定了血清4型群禽腺病毒聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。本标准所规定的血清4型群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血

3、清4型群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型群禽腺病毒核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血清4型群禽腺病毒Fowl adenovirus group I Serotype 4是引起禽心包积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄5周龄家禽突然死亡，并伴随

4、有心包积水和肝炎。3.2实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR（qPCR）通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。4 实验室要求4.1 环境4.1.1 实验室符合GB19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全级（BSL-2级）及以上实验室。4.1.2 从事PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污

5、染。4.1.3 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做处理。4.2 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。4.3 仪器设备4.3.1 生物安全柜。4.3.2 PCR仪（温度差小于0.3 ）。4.3.3 台式低温高速离心机（最大转速为15000 rpm）。4.3.4 电泳仪。4.3.5 电泳槽。4.3.6 紫外凝胶成像仪。4.3.7 冰箱：2 8 。4.3.8 冰柜：-20 。4

6、.3.9 微量移液器（最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1000 L），带滤芯的枪头。4.3.10 电子天平：精度为0.001 g。4.3.11 电磁炉或微波炉。4.3.12 荧光定量PCR仪。4.4 试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682规定的一级水。4.4.1 DNA提取试剂盒。4.4.2 rTaq DNA聚合酶：5U/L。4.4.3 10PCR 缓冲液。4.4.4 dNTPs：2.5 mmol/L, 10 mmol/L。4.4.5 荧光定量PCR试剂盒。4.4.6 1.5%琼脂糖凝胶，见附录A.1。4.4.7 1TAE缓冲液，见附录A.2。4

7、.4.8 溴化乙锭（10 g/L），见附录A.3。4.4.9 核酸电泳加样缓冲液，见附录A.4。4.4.10 DNA分子量标准，要求在100 bp2000 bp之间，有5条以上的指示条带。4.4.11 阳性对照标准品，已知的血清4型群禽腺病毒SPF鸡胚尿囊液。4.4.12 阴性对照标准品，经高压灭菌的超纯水。4.4.13 PCR检测所需引物： 上游引物F：5-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3； 下游引物R：5-TTTACACGGCGTTGCCTGT-3，扩增片段长度为568bp，引物浓度为100 mol/L。4.4.14 荧光定量PCR检测所需引物： 上游引物1983F：5-C

8、GTCAACTTCAAGTACTC-3； 下游引物2068R：5-AGAGGATGCTCATGTTAC-3； 探针P：5FAM-CCTACTCAGATGGAGGCTTCTACC-TAMRA3，扩增片段长度为86bp，引物浓度为100mol/L。5 样品5.1 样品采集与运输采集疑似血清4型群禽腺病毒感染死亡家禽的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理；活禽采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4 ，时间不超过24h。5.2 样品保存5.2.1 样品应放在含有抗生素的pH值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，附录A.5）内。5.2.2 抗生素的选择应视当地情

9、况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 g/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL），加入抗生素后pH值应调至7.07.4。5.2.3 在室温放置1 h2 h内样品应尽快处理，不能处理的可在4 存放，不超过24 h。5.2.4 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 低温条件下保存，不超过2 wk；-70 贮存不超过30d。5.3 样品处理5.3.1 在生物安全柜中进行样品处理，取10 g20 g样品放入灭菌的研钵中磨碎。5.3.2 咽喉或泄殖腔拭子，置于200 L含有青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆

10、大霉素（50 g/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL）的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中。5.3.3 研磨充分的组织用含青霉素（2000 IU/mL），链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 g/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL）pH值7.07.4的等渗PBS溶液配制成10%20%（g/mL）的悬液。样品经8000r/min离心10 min，取上清液作为材料，进行后续试验。5.4 对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品或阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。5.5 DNA提取按照DNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照组的DNA。提取的DNA应立即检测，否

11、则应置于-70 冻存。5.6 PCR反应5.6.1 PCR的反应体系10PCR Buffer 2.5 L, dNTPs（2.5 mmol/L）2 L，引物F（100 mol/L）和R（100 mol/L）各0.5 L，模板DNA 3 L，rTaq DNA聚合酶0.25 L，加超纯水至25 L。5.6.2 PCR反应条件94 预变性5 min；94 30 s，53 30 s，72 30 s，30个循环；72 延伸10 min。5.6.3 琼脂糖凝胶电泳PCR反应结束后，取9 L样品与1 L核酸电泳加样缓冲液混匀后，与1.0%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5

12、 V/cm电压，电泳30 min。电泳后，置于凝胶成像仪观察，根据分子量标准判断PCR扩增产物大小。5.7 实时荧光定量PCR反应5.7.1 实时荧光定量PCR反应体系Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 L，Rox Reference Dye II 0.2 L，引物1983F（100 mol/L）和引物2068R（100 mol/L）各0.4 L，探针P（100 mol/L）0.4 L，模板DNA 2 L，加ddH2O至20 L。反应液混匀后置于ABI 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。5.7.2 实时荧光定量PCR反应条件95 预变性30 s；95 变性5 s，62

13、 退火32 s（收集信号），进行40个循环。6 结果判定6.1 阳性对照出现相应大小的扩增条带或扩增曲线，且阴性对照无扩增条带或扩增曲线时，判定检测结果有效。6.2 血清4型群禽腺病毒PCR产物大小为568bp。阳性对照出现568bp扩增条带，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时试验成立。被检样品出现568bp条带为血清4型群禽腺病毒阳性，否则为阴性（附录B.1）。6.3 血清4型群禽腺病毒荧光定量PCR阳性对照出现S型扩增曲线，且Ct值小于35，阴性对照无S型扩增曲线，且Ct值大于35时试验成立。被检样品出现S型扩增曲线，且Ct值小于35为血清4型群禽腺病毒阳性，否则为阴性（附录B.2）。

14、AA附录A （规范性附录）相关试剂的配制A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖1.5 g0.5TAE电泳缓冲液加至100 mL微波炉中完全融化，待冷至5060时加入溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀。倒入板上凝固后，取下梳子，备用。A.2 1TAE电泳缓冲液的配制A.2.1 配制0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na22H2O）18.61 g灭菌双蒸水80.0 mL氢氧化钠调pH至8.0水加至100 mL用于配制A.2.2中的50TAE电泳缓冲液A.2.2 配制50TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g冰醋酸57.1 mL0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）100 mL水加至1000 mL用于配制A.2.3中的1TAE电泳缓冲液A.2.3 配制1TAE电泳缓冲液50TAE电泳缓冲液20 mL水加至1000 mLA.3 溴化乙锭的配制溴化乙锭20 mg水加至20 mLA.4 核酸电泳加样缓冲液（10）聚蔗糖25