细胞生物学课件：专题九、衰老

1、第九章 细胞衰老与凋亡,一 细胞衰老,（一）基本概念 cellular aging / cell senescence 100年前, 人们认为除单细胞原生生物外,多细胞生物的体细胞会衰老和死亡.朴素观点 鸡心脏细胞无限生长和分裂（连续培养34年）、hela细胞系的建立等实验，证明了细胞“不死性”的观点：细胞本身没有衰老与死亡，细胞衰老的原因不在细胞本身，而是由于体内和体外环境的影响结果。 有实验根据 Hayflick Limitation（1961）：细胞不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。即，细胞的增殖能力和寿命是有限的。,实验一：胎儿和成人肺成纤维细胞

2、可在体外分别传代50次和20次（年龄）。 实验二：早老症成纤维细胞在体外只能传代24次（反映细胞在体内状况）。 实验三：龟（175岁）的培养细胞的传代数90125次，小鼠（3.5岁）的传代数1428（寿命长短）。 实验四：老年男性细胞和年轻女性细胞的倍增次数实验（巴氏小体标记）。（细胞内部，而不是细胞外部决定细胞衰老）。 实验五：去核的胞质体与完整细胞杂交实验，与胞质体细胞的年龄无关（细胞核决定细胞衰老）。 所以，对于细胞而言，衰老是不可避免的，衰老的原因在于细胞本身。,（二）细胞在体内条件下的衰老,细胞的衰老和死亡不仅发生在成体内，发育早期（蝌蚪尾和期）也有。 测定不同年龄小鼠小肠腺窝上皮细

3、胞的周期长度，发现随年龄的增高，细胞衰老，细胞周期长度明显延长（主要G1期）。 周期的延长就是细胞分裂能力的下降，这种变化是由于体内环境影响的结果：小鼠皮肤移植实验F1代、F2代等，皮肤细胞的寿命明显长于小鼠寿命；老年骨髓造血干细胞复壮实验,（三）衰老细胞结构的变化,细胞核变化：随着细胞分裂次数的增加，核不断增大；核膜内折；染色质固缩；有的细胞核的核仁裂解为小体。 内质网变化：粗面内质网的总量呈减少趋势；原来的有序排列被打乱。体外培养的人胚肺成纤维细胞在26次倍增前内质网膜腔膨胀扩大，含有不定型的致密物，且为核糖体所覆盖；而40次以后细胞内质网膜腔未见膨胀，不定型致密物少，且具无核糖体覆盖区。

4、 线粒体变化：数量减少，体积增大，有时外膜破裂。,致密体生成：衰老细胞常见的一种结构。又称脂褐质、老年色素、血褐质、黄色素、透明蜡体、残体等。是由溶酶体或线粒体转化而来的。 膜系统变化：年轻细胞的膜相为液晶相，脂双层柔韧，脂肪酸链能自由移动，相邻脂质分子之间的位置交换极其频繁，膜蛋白表现出最大的生物学活性。衰老细胞的膜处于凝胶相或固相，磷脂的脂肪酸尾巴“冻结”，不能自由移动，膜的刚性增大，使膜蛋白不能运动。此时，机械刺激或压迫，就会出现裂隙，通透性受损。细胞连接明显减少。,（四）细胞衰老的机制,氧化损伤学说细胞从外界摄取氧的23%在代谢过程中，产生活性氧基团或分子（reactive oxyge

5、n species,ROS）：超氧自由基（.O2）、羟自由基（.OH）、过氧化氢（H2O2）。它们可引发脂质、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤，从而导致细胞结构的损伤和破坏。这些氧化性损伤的积累，最终导致细胞衰老。如果清除ROS，就可以延长寿命，如SOD。 有丝分裂钟学说Telomere是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。它们在细胞分裂过程中不能被DNA聚合酶完全复制，而是随细胞分裂的不断进行而逐渐变短。随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短；当端粒长度缩短到一个阈值时，细胞就进入衰老。 端粒酶（Telomerase）可催化合成端粒重复序列并加在染色体末端。端粒酶由RNA和蛋白

6、质组成，前者是合成端粒DNA的模板，后者是反转录酶亚基。生殖细胞和癌细胞中含有端粒酶。如果将端粒酶基因转染到正常人二倍体细胞中，可明显延长细胞寿命。,rDNA与衰老在一种酵母（S. cerevisiae）中，已经确定细胞衰老的步伐是由rDNA的变化所决定的。rDNA以100200份串联拷贝存在于第12号染色体上，在酵母达到中年的某一时刻，通过同源重组产生的第一份环状rDNA片段膨冲而出，成为染色体外rDNA环（ERC）。随着分裂的进行，ERC不断复制增加，当积累到5001000份拷贝时细胞就进入衰老。（与下一个机理密切相关）,沉默信息调节蛋白复合物Silencing information r

7、egulator complex, Sir Complex Sir复合物通常存在于异染色质的端粒及与性别决定有关的HML和HMR位点上，其功能是阻止它们所在位点的DNA的转录。在Sir突变体中，Sir蛋白由端粒向核仁转移，使核仁rDNA处于沉默状态，抑制了复制及ERC的生成，阻止细胞衰老，而使生命延长。,线粒体DNA与衰老随着年龄的增长，线粒体DNA的突变是相当显著的。而线粒体DNA中存在着衰老DNA (Sen-DNA)。由于线粒体DNA参与电子传递链中某些成分的编码，所以线粒体DNA的突变可能导致电子传递链不能执行正常功能，促进活性氧基团的生成。 SGS1基因、WRN基因与衰老酵母中，90以

8、上的SGS1蛋白定位于核仁，如果核仁缺少SGS1，它就会裂解。在SGS1突变细胞中，其核仁结构在年轻细胞中正常，而在年老细胞中核仁裂解为小体。人成纤维细胞中，WRN基因也定位于核仁中，其功能是编码DNA解旋酶，保证细胞生命周期正常进行，如果发生突变就引起衰老提前发生和寿命的缩短。,二、细胞凋亡,（一）细胞凋亡的概念及生物学意义 1965年Kerr观察大鼠肝细胞，在局部缺血条件下不断转化为膜包的小的圆形细胞质团，称此现象为“皱缩型坏死”。由于这些细胞质团是在生理条件下产生的，1972年改称为“细胞凋亡”。90年代后，方兴未艾。 细胞凋亡（apoptosis）是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏过

9、程，自动结束其生命。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，又称为细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。,通过细胞凋亡，有机体清除不再需要的细胞（蝌蚪尾消失、手和足的成形、50%的神经细胞；成体的骨髓和肠每小时有10亿个细胞凋亡、被病原感染细胞的清除）；淋巴细胞的克隆选择过程中，细胞凋亡起着关键的作用；各种免疫细胞对靶细胞的攻击并引起其死亡，也是基于细胞凋亡。 诱导细胞凋亡的因子有两大类： 物理因子射线（紫外线、射线）、较温和的温度刺激(热激、冷激) 化学及生物因子活性氧基团和分子、Ca2+载体、VK3、视黄酸、细胞毒素。DNA和蛋白质合成抑制剂、正常

10、生理因子（激素、细胞生长因子）的失调、肿瘤坏死因子等。,细胞凋亡举例,（二）细胞凋亡与坏死,细胞坏死与细胞凋亡是两种完全不同的过程和生物学现象，它是因病理而产生的被动死亡,细胞膜发生渗漏，细胞内容物释放到胞外，导致炎症反应。,（三）细胞凋亡的变化过程,形态学变化过程： 凋亡的起始历经数分钟。细胞表面的特化结构（微绒毛）消失，细胞间连接消失，但细胞膜完整并具选择透性；线粒体基本完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形结构，沿核膜分布。 凋亡小体的形成染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器（线粒体）一起聚集，被反折的细胞膜所包围，使细胞表面形成了

11、许多泡状或芽状突起。以后，逐渐分割，形成单个的凋亡小体。 凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。整个凋亡过程需要49小时。,a 正常T细胞杂 b 凋亡细胞； c 凋亡细胞(透射电镜) 交瘤细胞；,生化变化过程： 在核酸内切酶（Ca2+ / Mg2+激活；Zn2+抑制）的催化下，核小体间的DNA断裂，产生含有180200bp整倍数的片段。这些片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带(DNA ladders)。这也是鉴定细胞凋亡的一种可靠方法。 凋亡细胞的组织转谷氨酰胺酶(tTG)不断积累并达到较高水平。tTG催化某些蛋白质的翻译后修饰，导致蛋白质聚合。这些蛋白质不溶于水，不为溶酶体所降

12、解，它们进入凋亡小体，有助于凋亡小体完整性的保持，防止有害物质逸出。,（四）细胞凋亡的检测,主要基于DNA的断裂。 形态学观察各种染色法：台盼蓝； DAPI是一种与DNA结合的荧光染料， 可观察细胞核的形态变化； Giemsa染色可以观察染色质固缩、趋边、 凋亡小体的形成等；透射电镜和扫描电镜。 两种染料复染更好。 DNA电泳凋亡细胞中提取的DNA进行常规 琼脂糖电泳时，大小不等的DNA片段（180 200整倍数）呈现梯状条带。,彗星电泳法（comet assay）将单个细胞悬 浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场 中进行短时间的电泳，用荧光染料染色后，凋 亡细胞中形成的DNA降解片段在电

13、场中泳动速 度不同，使细胞呈现一种彗星式的图案；而正 常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形。 流式细胞分析采用碘化丙锭使凋亡细胞 DNA片段产生激发荧光，用流式细胞仪检出 凋亡的二倍体细胞，同时又能观察细胞的周 期状态。,（五）细胞凋亡的机制,1、caspase家族与凋亡 Cysteine aspartic acic specific protease是一组结构相关的半胱氨酸蛋白酶，存在于细胞质中，共同特点是能特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。所以，可以选择性地切割某些蛋白质，使其活化或失活。目前发现11种caspase成分（caspase111）， 其中，1、11和4不直接参与凋亡信号的转导，而是参与白介素的活化；2、8、9和10参与细胞凋亡的起始；3、6和7参与细胞凋亡的执行。 哺乳类细胞内存在编程性细胞死亡抑制因子（inhibitor of apoptosis,IAP）家族，如XIAP, cIAP1, cIAP2，可特异地抑制caspase3和7。,2、Bcl2家族 Bcl2是 一种原癌基因，能延长细胞的生存，抑制细胞凋亡。 在胚胎发育过程中，BCL2的表达十分常见，但在成熟组织中，只有那些长期生存的细胞（干细胞、分裂后的神经元等细胞）才表达。Bcl2家族成员的基因中，常常含有三个保守