医学微生物学实验课件：实验5

1、实验五 主要内容 （一） 凝集反应 （二） 补体结合反应 （三） 血清总补体测定,颗粒性抗原（病原微生物或红细胞）与相应的抗体特异性结合，在电解质存在的条件下，如果两者比例适当，在一定的温度下经过一定的时间，可以形成肉眼可见的凝集块，这种现象叫做凝集反应。,凝集反应,直接凝集反应：玻片法、试管法。 间接凝集反应 抗人球蛋白试验,凝集反应,试管凝集反应（4人一组）,试管凝集反应为一种定性、半定量试验，用已知的颗粒性抗原检测血清中未知抗体及相对含量。 利用生理盐水将待检血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量的已知抗原悬液，经过一定时间后，观察有无凝集并根据凝集程度判定血清中抗体的效价。

2、,1:10溶血素0.5ml,步骤与方法 1取小试管7支，排列于试管架上并做好标记。 2每管各加入生理盐水0.5ml。 3吸取1 : 10绵羊红细胞免疫血清（溶血素）0.5ml放入第1管中充分混匀。 4自第1管中吸出0.5ml加入第2管中，经充分混匀后吸出0.5ml加入第3管中，如此依次稀释至第6管，混匀后吸出0.5ml弃去，第7管不加血清做对对照。,弃去0.5ml,517管每管各加入1%绵羊红细胞（SRBC）悬液各0.5ml（注意：加入前必须先将SRBC悬液充分混匀）。 6此时第16管的血清稀释度为1 : 40，1 : 80，1 : 160，1 : 320，1 : 640，1 : 1280。摇

3、匀后，置37温箱，次日观察结果并记录。 倍比稀释：Ag or Ab？,结果 1观察前切忽摇动试管，以免凝集分散。 2先观察对照管，该管应无凝集现象，血球沉于管底呈圆点状，如出现凝集则说明操作有错误或非特异凝集，试验结果不能成立。 3再观察16试管，并以 、 、 、分别表示凝集强度。,结果判断,：血球完全凝集，成厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。 ：血球呈薄层贴于管底，边缘不整齐。 ：血球在管底的中央呈小圆盘状，边缘凝集呈颗粒状。 ：血球呈较大的圆盘状沉淀，边缘凝集颗粒很少。 ：无凝集，血球沉于管底呈圆点状，边缘整齐。,效价：生物制品活性（数量）高低的标志。以血清最高稀释度仍能出现“ ”凝集现象者，

4、作为该血清的效价（滴度）。 1 2 3 4 5 6 7 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照 1 + + + + - - - 2 + + + + + + - 3 + + + - - - - 4 + + + + + - -,抗体过剩,抗体抗体比例合适,抗原过剩,网格学说（lattice theory）,补体结合试验（4人一组）,是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。本实验操作繁琐，但补体结合抗体出现早、消退快，有助于早期诊断。,补体结合试验,抗原-抗体, 补体, 绵羊红细胞-溶血素,溶血,不溶血,

5、抗原与抗体对应,抗原与抗体不对应,（待检系统） 已知Ag或Ab 待检Ab或Ag,（指示系统）,仅供1组Ag-Ab系统反应的定量补体，不能过多或过少。,步骤与方法,溶血,不溶血,结果 观察各管溶血情况，记录并分析意义。 管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,血清总补体测定（50溶血法 ） （4人一组） SRBC （抗原），与相应抗体（溶血素）结合后，可激活待检血清中的补体而导致SRBC溶血。当SRBC与溶血素浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与SRBC与溶血素反应，测定溶血程度，可测知补体总溶血活性。,血清总补体测定（50溶血

6、法 ） 由于补体含量与溶血程度之间呈正相关，但不是直线关系，而呈S曲线关系。曲线二端平坦，补体量的增减对溶血程度影响不大，而在曲线中段（50%溶血附近）曲线斜度最陡，几乎成一直线，补体量的细微变化可引起溶血程度明显改变，故取50%溶血为终点观察指标，以精确检测血清补体的含量。,补体量,步骤与方法 1配制50%溶血标准管已配制完毕 2ml 2%SRBC悬液加8ml蒸馏水，混匀，使完全溶血。取此液体2 ml加生理盐水2ml，混匀后即为50%溶血管。,标准管,步骤与方法 2正式试验：取1:30的稀释血清（1:30 补体）按下表所示加样。,50%溶血试验加样表 单位：ml,步骤与方法 将管内各成分混匀，置37水溶30分钟后，离心2000rpm5分钟。 将其与标准管目测比色，选择目测色泽最接近的管为终点。,标准管,3,4,步骤与方法 5. 根据各管