蛋白质冻融过程中的物理化学变化

1、蛋白质冻融,冻融过程到底发生了什么？ 低温生物学 化学 热动力学 晶体学 冻融胁迫的产生 冻融保护,蛋白质冻融,冰晶 浓度差异 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况,肉眼能观察到的冻融现象,不均匀的体系变化,融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5/min：室温或自来水摇 intermediate warming 5/min：37或以上的水浴,目前常用的冻融工艺步骤,冷却cooling 冷冻freezing 等温保持,生物样品常用存储温度,一、物理胁迫 低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成 二、化学胁迫,冷冻胁迫,低温变性效应 通常发生在0下，诱导蛋白质解折叠,蛋白质的吉布

2、斯自由能随温度变化趋势 认为跟温度下疏水残基的溶解度增加 变性温度与pH、蛋白浓度、添加剂(如糖、离液剂等)有关,低盐 低温,-lactoglobulin chymotrypsinogen lactate dehydrogenase myoglobin phosphoglycerate kinase ribonuclease and staphylococcal nuclease,冷冻过程中的温度变化,溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离,2.冷冻浓缩效应,Figure 2. Temperature, % solute concentration, and v

3、iscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at 15C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data o

4、ver a wide range of composition and temperature to a Vogel-Tammann-Fulcher-type equation. Data taken from Reference 7,(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布,引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度,(2) pH变化 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 溶质结晶 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移，不同离子迁移性质与速率不同,KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出 KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，6 N

5、aCl 引起pH降低，4,Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and Mechanisms of Protein Stabilization,没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解 分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生,提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。,共晶点：-16.7 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生,没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化,重组血红蛋白 hemoglobin在PEG-Dextran系统中的相图,(3)相分离现象 诱

6、导蛋白质结构损伤 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定剂失去保护作用 改变稳定所需的分子间相互作用 形成两相界面（在不完全分离体系中，蛋白质大面积暴露） 可发生于 电解质-聚合物 聚合物-聚合物 聚合物-多糖 蛋白质-多糖 蛋白质-蛋白质 蛋白质-表面活性剂 糖-蛋白质-多糖 电解质-聚合物-多糖 存在相分离现象 PEG/PVP-Dextran PVP-ficoll PEG-磷酸盐,3. 冰晶形成 (1)冰晶生长 冷冻浓缩 (2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势 (3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和解折叠。结冰后水分

7、子与蛋白质分子距离发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静电、范德华力及疏水作用。 (4)组织结构破坏,快的冷却速率(小体积到液氮) ：往往形成大量小冰晶，更多的冰水界面,化学胁迫,1. 增强NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡 Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society,冻融保护/低温保护,样品浓度 冷冻降温/融化升温速率 3. 保护剂,2. 冻融时的温度变化速率对活性恢复的影响,3.保护剂,举例：过氧化氢酶活性影响,低温/冻融 保护剂 种类： 聚合物类 PVP/PEG 在冻结过程中优

8、先析出；具有一定的表面活性；提高溶液粘度；显著提高玻璃化转变温度；抑制溶液pH的降低。可以起低温保护剂和脱水保护剂作用。 多元醇 甘油/DMSO/乙二醇 强烈结合水分子，很强持水性，可与蛋白质形成氢键取代水，保证蛋白质稳定性。但甘油浓度提高至一定程度时，对蛋白质稳定作用能力可能达到了极限。渗入性保护剂 糖类 蔗糖/海藻糖 非渗入性保护剂，蔗糖在溶液中易结合水分子，发生水合作用，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，达到保护细胞的目的。 表面活性剂 改善冰晶的吸附，既能在冻结和脱水过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和脱水变性，又能在复水过程中对表面活性剂组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用,蔗糖缩短相变过程的时间,NaCl浓度的影响,Glycine在磷酸缓冲液中的保护作用 显著影响磷酸缓冲液在冻融时的pH变化 0-50mM 降低成核速率，减少磷