绿色荧光蛋白gfp标记方法

1、纤维素降解菌X-3的GFP标记,gfp质粒的提取,试验路线,gfp质粒+X-3感受态细胞,X-3感受态细胞的制备,电击转化,X-3-gfp标记菌,经过传代培养验证其稳定性，同时检测其相关理化特性（ph，温度，含氧量，转速等）是否受到影响，确定gfp标记的细菌可以用于进一步研究,GFP标记,菌落观察,油镜观察,本实验所需的的材料,1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H

2、2O 1000ml, pH 7.4 3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA,一.gfp质粒的提取,1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验 2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相关操作 3.采用1%琼脂糖凝胶电

3、泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） 微波加热至透明倒 入制胶板中 b.2 l质粒+2 l单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察结果，并记录,二.X-3感受态细胞的制备,1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于50 ml LB液体培养基中，30，170 r/min 振荡培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液体培养基中，30，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600 2.收集生长中期的培养物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤

4、液冲洗细胞4 次 。具体过程：用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保持冷却。,三.电击转化及荧光观察,1.用250lPEB洗涤液冲洗最后一次离心的菌体，分别分装到50l的离心管中 2.取50l感受态细胞+1l质粒（梯度分别为1l，2.5l，5l）置于电转杯上，用枪头轻轻吹吸，冰上冷却 3.电转仪电击 4.立即用LB培养液活化（1ml），转移到离心管中，震荡培养1h(120r,37) 5.取转化后的菌液，分别取10 ，50， 100l菌液涂布于含有100g/ml壮观霉素的LB固体培养基上，30培养

5、 6.取相关切片在荧光显微镜下观察是否标记上。,9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。20.9.2820.9.28Monday, September 28, 2020 10、低头要有勇气，抬头要有低气。00:53:5700:53:5700:539/28/2020 12:53:57 AM 11、人总是珍惜为得到。20.9.2800:53:5700:53Sep-2028-Sep-20 12、人乱于心，不宽余请。00:53:5700:53:5700:53Monday, September 28, 2020 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。20.9.2820.9.2800:53:5700:53:57September 28, 2020 14、抱最大的希望，作最大的努力。2020年9月28日星期一上午12时53分57秒00:53:5720.9.28 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。2020年9月上午12时53分20.9.2800:53September 28, 2020 16、业余生活要有意义，不要越轨。2020年9月28日星期一12时53分57秒