8章菌种保藏和 9章微生物的生态一

1、第八节 菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异； b）污染；c） 死亡.一、菌种的衰退(degenration)1. 衰退的表现 1）原有形态形状变得不典型； 2）生长速度变慢； 3）代谢产物生产能力下降； 4）致病菌对宿主侵袭力下降；5）对外界不良环境的抵抗力下降。2. 衰退的原因1） 根本原因在于基因自发突变；2） 传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占了优势；3） 与培养条件有关。衰退是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变的过程。二、衰退的防止与复壮（一）防止衰退的措施p2281

2、. 减少传代次数；2. 创造良好的培养条件；3. 利用不易衰退的细胞传代4. 采用有效的菌种保藏方法；（二）菌种的复壮（rejuvenation）1. 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种(狭义复壮，消极措施)。a）纯种分离;b）通过寄主体进行复壮；2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮，积极措施) 。纯种的分离方法平板划线分离法菌落纯平板涂布分离法平板倾注分离法用“分离小室”进行单细胞分离细胞纯显微操纵器进行单细胞分离菌丝尖端切割法进行单细胞分离三、菌种保藏基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不

3、乱培养基传代培养斜面、平板干燥沙土管、冷冻真空干燥液氮、低温冰箱冷冻基本方法：寄主传代培养生活态休眠态1. 原理人为地创造有利于微生物长期休眠的条件，主要是低温、干燥、缺氧。2. 保藏方法7种常用方法(p244表7-13）（1） 斜面冰箱保藏法（2） 半固体冰箱保藏法（3） 石蜡油封藏法（4） 甘油悬液保藏法（5） 沙土管保藏法（6） 冷冻干燥保藏法（7） 液氮保藏法ATCC采用的菌种保藏法：（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中心）冷冻干燥保藏法液氮保藏法CCCCM采用的菌种保藏法：（ China Committee for Culture

4、 Collections of Microorganism，中国微生物菌种保藏委员会）斜面传代法冷冻干燥保藏法液氮保藏法由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。本章重点一、了解证明核酸是遗传变异物质基础的3个经典实验比较：基因型与表型，变异与饰变质粒的概念，特点及主要类型。二、基因突变和诱变育种1. 基因突变的类型2

5、. 基因突变的规律3. 了解常用诱变剂及其诱变机制4. 艾姆氏法检测致癌剂的理论依据、方法和优点5. 了解诱变育种的主要环节及常用的初筛方法； 掌握UV诱变育种的操作程序及注意事项。6. 筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法， 淘汰野生型的方法7. 抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。8. 名词：营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基， 完全培养基，补充培养基，点突变，转换， 颠换，移码突变，染色体畸变，活作用三、基因重组与杂交育种1. 了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。名词概念：转化，转染，转导，普遍转导，局限转导，低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导，Hfr菌株， 溶源转变

6、。比较： 转化与转染，转导与性导，转导与溶源转变， 普遍转导与局限转导，LFT与HFT有性生殖与准性生殖，转化、转导、接合和原生融合2. E. coli F+、F-、Hfr和F菌株的异同及相互间关系。3. 原生融合的基本操作及优点。4. 酿酒酵母有性杂交的育种程序。四、基因工程名词，基本操作五、菌种的衰退、复壮与保藏1. 菌种衰退的表现、原因与防止措施。2. 菌种保藏的原理与常用的保藏方法。ATCC 和CCCCM采用的菌种保藏法。第九章微生物的生态生态学：研究生物及其环境条件间相互作用规律的科学 。根据生态学的研究对象和采用的研究方法不同, 生态学的分类不同。微生物生态学：在一定意义上也可以称

7、为环境微生物学，是研究微生物群体与其环境系统之间相互作用及其功能表达规律的科学 。微生物生态学研究的主要三个目的：阐明自然界中微生物的生物多样性和微生物群落中不 同群体之间相互作用的关系；测定自然界中微生物的活动并监测它们对生态系统的 影响；充分挖掘特殊生态环境中有益微生物，使其更好地为 人类服务。微生物生态系统：微生物与其周围的环境（包括动植物）组成的具有一定结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中，微生物之 间、微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 相互依存构成一个稳定的系统关系 。本章内容第一节 自然界中的微生物第二节 微生物生态学的研究方法第三节 微生物活性的测定方法第四

8、节 微生物在自然界物质循环中的作用第五节 微生物之间的关系第六节 微生物与环境治理第七节 瘤胃微生物生态系统第八节 产甲烷作用和互养共栖一、 土壤中的微生物土壤是微生物生长繁殖的天然培养基 ，是人类最丰富的“菌种资源库”。不同类型的土壤、同一类型土壤的不同深度或不同水平 位置，微生物种类和数量变化很大。由于表土层土壤比较干燥，且接受大量紫外线照射，所以微生物主要分布在营养条件良好、氧气含量比较丰富的浅土层第一节自然界中的微生物每克耕作层土壤含菌量十倍递减细菌（108）放线菌（107，孢子）霉菌（106，孢子）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）很异常的形态（例如柄细菌）；二、水体中

9、的微生物1. 淡水微生物游水中的微生物多，并且有很多对健康不宜作为饮用水源；净化作用：苛刻，因此在一般的水中只能存活23天作用而被杀灭；水底；5）水体自身存在自我1）数量和种类与接触的土壤有密切关系；2）吸附于悬浮在水中的有机物上及水底；3）多能运动，有些具有4）靠近城市或城市下不利的细菌，因此水中的病原微生物会对水质产生重要影响a）致病菌一般对营养要求b）水表微生物会受辐射等c）原生动物等的吞噬作用d）由固形物吸附再沉积饮用水的微生物指标：；总菌数： 100个/ml大肠杆菌： 3 个/L到在光线充足的沿岸带、湖水带分布着大量光 合藻类和好氧微生物（假单胞菌、嗜纤维菌、柄细菌、生丝微菌等）深水

10、带，光线少、溶解氧低，可见紫色和绿色硫细菌及其他兼性厌氧菌。湖底区分布着大量厌氧微生物，主要有脱硫弧菌、甲烷菌、梭菌等。水体的污染富营养化和“水花”、“赤潮”水体大量的有机物或无机物，特别是磷酸盐和无机氮化合物水的富营养化藻类等过量生长，产生大量的有机物异养微生物氧化这些有机物，耗尽水中的氧， 使厌氧菌开始大量生长和代谢分解含硫化合物，产生H2S，从而导致水有难闻的气味，鱼和好氧微生物大量死亡，水体出现大量沉淀物和异常颜色上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。“水花”或“水华”（water bloom）：藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体(淡水水体)出

11、现颜色， 并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。 赤潮或（red tides）：在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气养殖业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡，因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用严重人污类染健的康水会通过食物链的生物放大作用2. 海水微生物1）嗜盐，真正的海洋细菌在缺少氯化钠的情况下是不能生长的；2）低温生长，除了在热带海水表面外，在其它海水中发现的 细菌多为嗜冷菌； 3）大多数海洋细菌为革兰氏细菌，并具有运动能力；4）耐高压（特别是生活在深海的细菌）。三、 空气中的微生物1）无

12、原生的微生物区系；2）来源于土壤、水体及人类的生产、生活活动；3） 种类主要为真菌和细菌，一般与其所在环境的微生物种类有关；4）数量取决于所处的环境和尘埃数量；5）停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关；6）与人类的关系：传播疾病；造成食品等的污染；微生物学的基本技术：无菌操作技术四、 生物体内外的正常菌群1. 人体的正常微生物区系正常人体的皮肤、黏膜及肠道等部位，存在大量的、种类稳定 的微生物，称为人体正常菌群。皮肤表面：微球菌、链球菌、葡萄球菌和霉菌；肠道：大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌（厌氧菌占绝大多数）正常菌群与人体保持平衡状态，菌群内部的各

13、种微生物之间 相互制约，相对稳定。正常情况下，正常菌群与人体间是一种互生关系正常菌群通过肠道获取营养；正常菌群通过排阻、抑制外来致病菌； 能合成许多人体必需的维生素、氨基酸；环境条件改变或着生部位改变：正常菌群致病菌t虚弱抵抗力下降；t 吃了净的食物； 肠道中的正常菌群，大肠杆菌，一旦进入泌尿系统，引起感染人体表面的正常菌群，一旦它们进入伤口也会引起感染。条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位， 或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。可通过口服某些活的微生物制剂来治疗由于正常菌群失调而导致的腹泻。 含蜡状芽孢杆菌（B.cereus）的“促菌生”， 含地衣芽孢杆菌的“整肠生”

14、、 枯草芽孢杆菌和肠球菌的“妈咪爱”、它们都是通过芽孢杆菌的生长，为肠道重新创造良好的厌氧 环境，促使肠道内正常的厌氧菌的生长繁殖。含双歧杆菌和乳酸菌的“金三歧”、“培菲康”、“丽珠肠 乐”是通过乳酸菌产生乳酸来降低肠道pH而抑制菌的生长。这类活的微生物制剂又称为微生态制剂微生态制剂一般用于恢复肠道内的正常生态环境，若肠道功能正常，一般不需要服用！2. 无菌动物与悉生动物无菌动物：在其体内外不存在任何正常菌群的动物。悉生生物：人为地接种上某种或某些已知纯种微生物 的无菌动物（或植物）。用于科学研究：干扰因素少，操作易控制，既可进行定性分析，也可进行定量分析， 实验结果准确、可靠，对于了解微生物

15、与宿主之间复杂的关系及其机理具有十分重要的作用。五、 工农业产品上的微生物1. 工业产品大量工业制品都是直接或间接用动植物作原料来制造的纤维制品、木制品、革制品、橡胶制品、油漆、卷烟、化妆品等有些工业产品如塑料、建筑涂料等也有很多微生物可以分解、利用光学仪器上的镜头，建筑泥浆、钢缆、地下管道、金属材料等， 各种电讯器材、文物、书画等也可被多种特殊微生物所破坏。微生物在各类工业产品上的生长所造成的产品的霉腐给人类造成了巨大的损失!而另一方面，也想开发并推广使用可被微生物降解的产品，或利用微生物的降解特性。-生物可降解塑料-开发、利用纤维素（能源、饲料）-苎麻脱胶2. 食品、农副产品不利影响：由于

16、微生物的生长繁殖而腐烂、变质，不能再食用或使用；病原微生物进入人体的重要途径，引起传染性疾病；很多微生物在食品、农产品上生长后会产生对人有害的毒素；肉毒毒素、黄曲霉素等有利影响：利用特定的微生物制备风味食品，如酱制品、米酒、腌酸菜等；可采用多种方法防止微生物对食品等的破坏五、环境下的微生物嗜热微生物(thermophilles) 嗜冷微生物(psychrophiles) 嗜酸微生物(acidophiles) 嗜碱微生物(alkslinophiles)嗜盐微生物(halophile) 嗜压微生物(barophiles)研究意义： 开发利用新的微生物资源，包括特异性的基因资源； 为微生物生理、遗传

17、和分类乃至生命科学及相关学科许多 领域，如：功能基因组学、生物电子器材等的研究提供新的 课题和材料； 为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。第二节 微生物生态学的研究方法一、微生物生态研究中的传统方法 1样品的采集、富集培养和微生物纯培养分离 土壤和污泥样品采集 水体样品的采集 空气样品的采集 生物体上微生物样品的采集 采集样品的处理(数量测定,或富集培养,纯种分离) 2最大或然值法 将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，取一定稀释度的稀释液接种于液体培养基中，培养一定时间后，观察各稀释度的生长情况，以统计学的方法求出样品中微生物的数量 3活菌计数法 即平板活菌计数. 该法测定的是样品中所含的限

18、时可培养的活的微生物数量，对于那些不可培养的微生物，将不可能统计在内。 对于非培养态微生物的多样性和分布的研究，可采用直接显微染色观察、16SrDNA分子探针分析或PCR对特定基因的扩增等方法生态学研究中的原位观察显微镜观察法啶橙可以掺入DNA和RNA分子中，二、微生物 1. 激光聚焦 2. 染色法 荧光染料吖使土壤中的活细胞原位着色表面有特异的抗原成分，利用荧光标体，可以定量地估计自然生境中单一单一菌株的数量和分布拟技术微生境模拟术 微生物细胞记的特异抗菌群甚至是 3. 微生境模 实验室中的 原位培养技三、微生物生态学中的分子生物学方法 1. 核酸探针技术 2. PCR特异性扩增技术第三节

19、微生物活性的测定方法微生物活性的测定就是对微生物群落中各种群生态作用的大体估计 ,几种代谢相关群体的活性可以通过测量单一类型的代谢活动来评价。 一、特殊酶活性的测定 二、脱氢酶活性的测定 三、微生物呼吸率的测定 四、放射性同位素测定 五、微电极第四节微生物在自然界物质循环中的作用生态系统：物质循环生物群落所生活的非生物环境能量流动生物按其在生态系统中的作用，可划分为3大类群：生产者：从无机物合成有机物；消费者：利用有机物进行生活，一般不能将有机物直接 分解成无机物；分解者：分解有机物成无机物；生态系统的进化：地球起源化学进化原始物质生物进化原始生命（只有分解者，单级生态系统）双级生态系统（分解

20、者，生产者）三级生态系统（分解者，生产者，消费者）微生物在生态系统中的地位：1、微生物是有机物的主要分解者；微生物最大的价值也在于其分解功能2、微生物是物质循环中的重要成员；。它们分解生物圈内存在的动物和植物残体等复杂有机物质，并最后将其转化成最简单的无机物，再供初级生产者使用。微生物参与所有的物质循环，大部分元3、微生物是生态系统中的初级生产者；素及其化合物都受到微生物的作用。在一些物质的循环中，微生物是主要的成员，起主要作用；而一些过程只有微生物才能进行，起独特作用；而 有的是循环中的关键过程，起关键作用。光能营养和化能营养微生物是生态系统的初级生产者，它们具有初级生产者所具有的二个明显特4、微生物是物质和能量的贮存者；征，即可直接利用太阳能、无机物的化学能作为能量来源，另一方面其积累下来的能量又可以在食物链、食物网中流动。微生物和动物、植物一样也是由物质组成和由能量维持的生命有机体。在土壤、水体中有大量的微5、微生物在地球生物演化中的作用；生物生物量，贮存着大量的物质和能量。微生物是最早出现的生物体，并进化成后来的动、植物。藻类 的产氧作用及其它细菌的固氮作用，改变大气圈中的化学组成， 提供可利用的氮为后来动、植物出现打下基础。一、 碳素循环微生物的作用： CO2的固定（光合作用）CO2的再生（分解作用）微生物是自然界有机物最重要的分解者地球上90%以上有机物