细胞周期及其调控(讲义).ppt

1、医学分子细胞生物学,细胞周期及其调控 Cell Cycle ATM基因是AT唯一致病基因； 对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene） 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。 ATM编码蛋白激酶，与损伤DNA结合，信号通路有两条: 激活Chk1（check

2、point kinase）, 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,(3) P16INK4a P16INK4a基因位于人类染色体9p21区，编码由148个氨基 酸组成的分子量为16kD蛋白质。 P16INK4a与周期蛋白 D1竞争性结合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其对pRB 的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结 合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，P16INK4a间接抑 制包括DNA合成在内的多种生化

3、反应，使细胞周期正 常运行。,（4）pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。 在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下， pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1 限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行 及细胞的正常增殖。,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化； 磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以 及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具 特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢 叶酸还

4、原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些 基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK 激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入 核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.,G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络的共同模式,细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法 流式细胞仪测定法(Flow Cytometry) 缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分 裂间期和分裂期的准确时间。,细胞周期同步化1,人工选择同步化（ 药物诱导法） 条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用： 将与细胞周期调控有关的

5、条件依赖性突变株转移 到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,人工选择同步化2有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点：是 分离的细胞数量少。密度梯度离心法： 根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法 简单省时，效率高，成本低。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。,药物诱导法（DNA合成阻断法） G1/S-TdR双阻断法：将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。分裂中期阻断法 通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分

6、裂中期。优点：是操作简便，效率高。缺点：是这些药物的毒性相对 较大。,第三节 DNA受损阻止细胞 周期的分子学说,一、DNA损伤的后果:,信号传导异常,长期效应,老化,肿瘤,疾病,DNA 修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,二 、细胞衰老的理论 （一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累； （二） ROS引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤； （三）端 粒 钟 学 说（telomere clock theory) （四）衰老基因与抗衰老基因 1.衰老基因 人类：载脂蛋白E4基因、淀粉样蛋白基因 p

7、16, p53 p21 RB基因 2. 抗衰老基因 WRN bcl-2,CDK22，cyclinA、B 和 c-fos表达下降,不能是Rb磷酸化,E2F与Rb结合，从而不能发挥转录作用,细胞不能进入S期,细胞进入S期,生长因子,（二）细胞衰老的生化变化 DNA复制、转录、修复能力 端粒长度 DNA甲基化 DNA / chromosome 损伤 2. mRNA与核糖体结合能力 蛋白质合成能力 3.蛋白质分子损伤，功能 酶活性,第四节 细胞周期与疾病,一、癌与细胞周期 癌基因(oncogene) : 能促使细胞无限增殖、癌变的DNA序列。分若干基因家族（已发现近百种癌基因） 抑癌基因（suppre

8、ssion-oncogene)：存在于正常细胞中、能抑制细胞恶性增殖的基因。,1细胞周期驱动机制失控 Cyclins的过表达（Overexpression of cyclins） 肿瘤的发生与cyclin（D、E）过量表达有关。 Cyclin D1（Bcl-1）过表达原因（原癌基因） 乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因扩增过度。,基因突变: Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,染色体倒位（Chromosome inversion） Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制，Cyclin D1蛋白合成 染色体易位（Chromoso

9、me translocation) 甲状旁腺腺癌 Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 Cyclin D1表达, CDK 表达异常 主要见于CDK4、CDK6过表达。 CDK4+ cyclin D结合 CDK4/cyclin D CDKs表达 pRb pRb磷酸化 细胞增殖过度 E2F G1/S过渡加速,【Cyclin D过表达致肿瘤机制】 Cyclin D过表达 + 生长因子 CDKs瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变,可能, CDI表达不足和突变 肿瘤细胞中常出现CDI（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。 p16 InK4基因失活

10、原因 突变或缺失、染色体易位、p16 InK4高度甲基化。,Mechanism p16 InK4基因表达 CDK4与cyclin D结合 细胞周期处在“易于”被启动状态 易发生细胞癌变,G1/S交界处失察 P53 进入S期 DNA损伤 修复成功 G1/S检查 停顿G1期 损伤DNA修复 修复失败 细胞凋亡 下调bcl-2表达、激活bax 基因 P53,表2 人类肿瘤p53基因突变热点和频率 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肺癌 56 157，248，273 前列腺癌 30 不确定 结肠癌 50 175，245，248，273 肝细胞癌 45 249 食道癌 45 不确定 胶质癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌