医疗器械无菌检查.ppt

1、1,医疗器械-无菌检查,江苏省医疗器械检验所,2,主要内容,无菌定义及无菌检查定义 无菌检验依据 试验主要设备 实验环境条件及人员要求 培养基种类及配制要求 培养基适用性检查 试验菌种及菌液制备 无菌检查方法验证 供试品无菌检查及结果判断,3,无菌定义:无活微生物的状态。 无菌检查定义 ： 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。,（1）无菌定义,4,（2）无菌检验依据,本规范选用于中国药典2010年版二部附录XI H无菌检查法。 GB/T 14233.2-2005 医用输液、输

2、血、注射器具检验方法 ，第二部分：生物试验方法中规定的无菌试验方法。,5,（3）试验主要设备,超净工作台 细菌培养箱 霉菌培养箱 立式高压蒸汽灭菌器 台式高压蒸汽灭菌器 显微镜 生物安全柜 电热恒温干燥箱 集菌仪,6,试验仪器（1） - 超净工作台,7,试验设备（2）-隔水式恒温培养箱,8,试验设备（3）-霉菌培养箱,9,试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器,10,试验设备（5）-台式蒸汽灭菌器,11,试验设备（6）- 显 微 镜,12,试验设备（7）-生物安全柜,13,试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统,14,（4）实验环境条件要求：,无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部

3、洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。,15,（4）实验人员要求：,菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。,16,（5）培养基种类及要求,硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基,2012年12月,17,17,（5）培养基种类及要求,无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基,2012年12月,18,18,（5）培养基种类及要求,无菌检查 ：改良马丁

4、培养基：,19,（5）培养基种类及要求,保存时间： 制备好的培养基应保存在：2 25、避光 非密闭容器中：一般在三周内使用 密闭容器中：一般可在一年内使用,20,（5）培养基种类及要求,一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，配制时须迅速，以免吸潮影响称量的准确性，同时需注意灭菌后培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后灭菌使用。 新鲜配制的培养基，应符合中国药典规定的配方，对培养基进行挑选。,21,（5）培养基种类及要求,硫乙醇酸盐培养基：属于流体培养基，即在液体培养基中加入0.05%0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中的含氧量，使培养基在一段时间内保持厌氧的条件

5、，有利于厌氧菌的生长。硫乙醇酸盐培养基分装在适宜的容器中，其粉红色的氧化层适合需气菌的生长，在供试品接种前，培养基的氧化层的颜色不得超过培养基深度的15，调PH值灭菌后为7.10.2，分装，灭菌。 硫乙醇酸盐培养管置：3035培养14天。,22,（5）培养基种类及要求,改良马丁培养基：取培养基成分混合，微温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，摇匀，调PH值灭菌后为6.40.2，分装，灭菌。 改良马丁培养基：置2328培养14天。,23,（5）培养基种类及要求,培养基装量： 对于采用直接接种法检查的液体样品，培养基的装量与供试品装量相关，应根据供试品接种量确定培养基的装量，使供试品接种体积不大于培

6、养基的10%。 对于采用直接接种法检查的固体样品，培养基的装量均为100ml；一次性医用材料及医疗器具，若医疗器具体积过大，培养基的装量可2000ml以上，已将其完全浸没为准。 对于采用薄膜过滤法检查的样品，封闭式薄膜滤器的培养基装量为100ml 。,24,（6）培养基适用性检查,新购的培养基或自配的新鲜培养基要求： 无菌性检查： 每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。 灵敏度检查： 其质量均应符合灵敏度检查要求。用于培养基灵敏度检查的菌种如下：菌种的传代的次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代）。,25,（6）培养基适用性检查,菌种：试验用菌株及菌液制备

7、： 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 铜绿色假单胞菌CMCC(B)10104 大肠埃希菌CMCC(B)44102 枯草杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 菌种的要求： 不得超过5代。采用适宜的方法保存；并以保证试验菌株的生物学特性。,26,（6）培养基适用性检查,菌液制备 一般当日使用。 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，少许接种至营养肉汤基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养18 24h； 白色念珠菌的新鲜培养物接种改良马丁培养基中， 2328培

8、养24 48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量小于100cfu/ml菌悬液； 黑曲霉 菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上， 2328培养5 7天，使大量的孢子成熟。加入3 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成小于100cfu/ml 的孢子悬液。（见表）,27,（6）培养基适用性检查 中国药典2010年无菌检查验证试验中使用7株菌见下表,28,（6）培养基适用性检查,培养基接种 金黄色葡萄球菌2支 铜绿假单胞菌2支

9、 硫乙醇酸盐流体培养基 枯草芽孢杆菌2支 生孢梭菌2支 9支培养基装量12ml，空白对照1支。 分别接种小于100cfu/ml金葡、铜绿、枯草、生孢各2管，另1支不接种做空白对照，培养3天，逐日观察结果。,29,（5）培养基适用性检查,培养基接种 白色念株菌2支 改良马丁培养 黑曲霉2支 （5支培养基装量9ml，其中1支做空白对照） 分别接种小于100cfu/ml白色、黑曲各两支，另1支不接种做空白对照。培养5天，逐日观察结果。,30,（6）培养基适用性检查,结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,31,（7）试验(验证)菌种及菌液制备,菌种

10、：试验用菌株及菌液制备： 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 大肠埃希菌CMCC(B)44102 枯草杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003,32,（6）试验菌种及菌液制备,10倍梯度稀释 选择适宜的3个稀释级别 要求100cfu/ml,33,（7）无菌检查方法验证,验证准备条件： 稀释液、冲洗液及其制备方法 0.1蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 制备的菌液，应当日使用。,34,（7）无菌检查方法验证,目的: 证明所采用的方法适合于该供试品的无菌检查 确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或

11、其抑菌活性可以忽略不计。 确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。,35,（7）无菌检查方法验证,菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 4 4102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。 方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。,36,（7）无菌检查方法验证,菌液制备： 金黄色葡萄球菌（大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌) 接种营养肉汤（或营

12、养琼脂培养基） 生孢梭菌接种硫乙醇酸盐流体培养基 3035培养1824小时； 白色念珠菌接种改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养基）2328培养2448小时 上述培养物 用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬液。 黑曲霉接种改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，加入35ml 0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗 吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内用0.9无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu的孢子悬液。,37,（7）无菌检查方法验证,薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的

13、冲洗液中加入试验菌（小于100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为对照.将含培养基的容器按规定温度培养35天。 各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。 （如下图示）,38,（7）无菌检查方法验证,薄膜过滤法 规定量的供试品 过滤 硫乙醇酸盐流体培养基 滤膜 接种 改良马丁培养基 冲洗 每种菌均作1管不含供试品管作为对照 加入试验菌 过滤,39,（7）无菌检查方法验证,直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；

14、取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养35天。（如下表）,40,（7）无菌检查方法验证-直接接种法,41,（7）无菌检查方法验证,结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用： 1)增加冲洗量，或增加培养基的用量； 2)使用中和剂或灭活剂、更换

15、滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。,42,（8）供试品无菌检查,在100级超净台内，应在酒精灯火焰周围，以无菌操作法将规定量的供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基（不少于15ml/管）和改良马丁培养基（不少于10ml/管）的容器中。 注意事项： 严格遵守无菌技术操作，切勿人为造成污染； 试验器具温度不可过高以免将可能存在的菌烫死。,43,（8）供试品无菌检查,供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。 供试品若有两层（或两层以上）包装的，进入无菌检验室需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。 开启洁净区紫外灯和空气过滤装置并其工作1小时以上。 操作人员

16、准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。 每次试验中所用物品必须计划好，并有备用,44,（8）供试品无菌检查,无菌检查法包括： 薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。,45,（8）供试品无菌检查,细菌检测管：硫乙醇酸盐流体培养基+供试品 真菌检测管：改良马丁培养基+供试品 阳性对照管：对应阳性菌+对应培养基+供试品 阴性对照管：应取相应的溶剂和稀释液或冲洗液 +培养基,46,（8）供试品无菌检查,检验数量： 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。 一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法

17、，应增加最小检验数量的1/2作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量做阳性对照用。,47,（8）供试品无菌检查,检验量： 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。 采用直接接种法时：若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。 采用薄膜过滤法时：检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。,48,（8）供试品无菌检查,直接接种法： 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，

18、改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。,49,49,（8）供试品无菌检查,阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 阴性对照：目的是验证相应溶剂和稀释液本身是否存在污染，防止假阳性。,50,50,（8）供试品无菌检查,阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu/ml，供试品用量同供试品无菌检查每份接种量相同。阳性对照管培养48 72小时应生长良好。 阳性对照：目的

19、是验证试验结果可靠性，防止假阴性。,51,51,（8）供试品无菌检查,薄膜过滤法： 2010年版中国药典规定:只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。 在蠕动泵的作用下，被测产品通过装有带空气过滤器的针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，免去了通常膜转移过程中易产生的污染。 无菌检查法中薄膜过滤法所用的滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50mm。,52,52,（8）供试品无菌检查,水溶液供试品,取规定量的供试液，直接过滤，或混合至适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。,供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为 100ml，总冲洗量不得超过1000mL，以免滤膜上微生物受损伤。,冲洗后分别将1