生物分离工程期末复习

1、生物分离工程（Bioseparation Engineering）,Reference-books,田瑞华生物分离工程北京：科学出版社，2008 曹学君现代生物分离工程上海：华东理工大学出版社，2007 毛忠贵生物工业下游技术北京：中国轻工业出版社，1999 严希康生化分离工程北京：化学工业出版社，2001 孙彦生物分离工程北京：化学工业出版社，2005,Reference-webs,华东理工大学 福州大学 南京工业大学 ,Reference-journals,色谱 膜科学与技术 离子交换与吸附 生物工程学报 高校化学工程学报 现代化工 化工进展 化工学报 化学工程 化学工业与工程 China

2、 Journal of Chemical Engineering,References-SCI journals,Journal of Chromatography A Journal of Supercritical Fluids Journal of Membrane Science ,References-SCI journals,Enzyme and Microbial Technology Biochemical Engineering Journal Separation and Purification Technology ,References-SCI journals,Bi

3、otechnology and Bioengineering Journal of Separation Science Journal of Chemical Technology and Biotechnology ,References-SCI journals,Separation and Purification Reviews www.tandf.co.uk/journals/titles/15422119.asp Separation Science and Technology www.tandf.co.uk/journals/titles/01496395.asp,第一章 绪

4、论,生物工程（Bioengineering），即生物技术(Biotechnology) 是通过对有机体的操作，利用生物有机体来生产有用物质，改善人类生活品质的技术。 生物工程的主要目标是生物物质的高效生产，而分离纯化（Biosepration and purification）是获得生物物质的重要技术环节，因此生物分离工程（Biosepration engineering）是生物工程的重要组成部分。,第一节 概述,生物工程研究领域,微生物培养 动物细胞培养 植物细胞培养 天然资源 生化材料 海洋生物培养,生物工程产业领域,生物制药（抗生素，基因重组蛋白，氨基酸，疫苗，菌苗，天然药物，生化药物，

5、血液制品，抗体，多糖，多肽） 生物化工（乳酸，柠檬酸，苹果酸，丙烯酸，甘油，异丙醇，乙烯） 生物能源（甲醇，乙醇，生物柴油，生物汽油） 生物材料（明胶，胶原蛋白，人造皮肤，从造骨，人造脏器） 生物医学 （诊断试剂，基因治疗，人及生物克隆） 环境生物（环境治理，水污染，土壤污染，风沙治理） 生物食品（醋，啤酒业，酿酒，乳制品，奶制品） 生物资源（动物，植物，微生物） 生物农业 （基因食品，基因植物）,生物工程的上中下游,在生物工程领域，一般将生物产品的生产称为生物加工过程（Bioprocess），分为上游、中游、下游三部分。 上游：菌种选育，基因工程，分子生物学，遗传学 中游：微生物发酵工程，动

6、植物细胞工程， 海洋生物培养 下游：生物分离工程,生物分离工程（Bioseparation engineering）：对由生物界自然产生的、由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程所获得的生物原料，经提取分离加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也可以称为下游技术，或者下游工程。 广义：细胞的大规模培养、产物的分离纯化、产品的成型加工和质量监控等,分离是混合的逆过程，不能自发进行，需要作功才能实现，而且需要有专门的工艺和设备。 在实际的工业生产中，目的产物往往与大量杂质混合在一起，分离的任务，就是从这些混合物中用最低的投入（物力、财力和人力），获得最高的产出

7、（如产物的高得率、高纯度）。,在工业化生产方面,分离纯化是生物技术产业的瓶颈。 下游加工过程的费用占全部产品研发费用的60以上； 在成本构成中，分离与纯化部分占产品成本的比例很高。 开发新的分离纯化工艺是降低成本、提高经济效益的重要途径。,Bioseparation cost,R. Ghosh. Principles of Bioseparations Engineering. New York: World Scientific, 2006,结构基因组的研究,在基础研究方面,结构基因组研究的制约因素,在蛋白质克隆和表达系统被不断优化的同时，分离纯化过程、蛋白质的错误折叠及产物的不溶及聚合，已

8、成为结构基因组计划发展的制约因素。,生物分离工程包括目标产物的提取（isolation）、浓缩(concentration)、纯化（purification）、成品化(product polishing)等过程。 由于生物产品的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性，因此导致了生物分离工程的成本往往占整个生产成本的大部分。,生物分离工程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品； 费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的，而对重组蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的； 关注程度：英国政府工业部于年发起生物分离计划（），专门研究下游加

9、工过程；年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于年在济南召开了一次专门会议；近年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。,第二节 生物分离工程的 重要性和特点,化工分离技术：获得纯的化学物质 生物分离技术：在得到纯的生物物质同时，还必须关注其活性的保留和特定杂质的去除；,生物产物对有害物质有严格的控制，生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害杂质存在。,与化工分离技术的区别,生物物质的生物活性要求温和条件，需快速分离 对纯度要求高，需除去热源物质； 产物成分复杂，需合理设计过程达到高效分离； 原料液中目标产物的浓度低。(青霉素含量为3.6，

10、庆大霉素为0.2，胰岛素仅为0.001),生物下游加工过程的特点,最终结果：导致生物分离工程成本往往占整个生物加工过程生产成本的大部分。生物分离工程的质量往往决定了整个生物加工过程的成败。,生物原料的特点 复杂的多相体系，非牛顿流体，成分复杂 如发酵产品：粗原料产物、微生物代谢产物（metabolome）、各种添加剂，混合物产物数以万计。,Metabolic network,生物原料的特点 发酵或培养大多是分批操作，各批产物浓度和其他物性会出现差异，也会出现异常 生物活性物质的稳定性差 如原料液中常存在降解目标产物的蛋白酶、菌体也可能自溶、容易被杂菌污染：发酵液放罐后，应及时快速操作，要求采用

11、快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。 原料液中常存在与目标分子结构极其相似的分子如同系物及异构体。,含水多，产物含量低； 含菌体蛋白； 溶有原来培养基成分； 相当多的副产物和色素； 易被杂菌污染或使产物进一步分解； 易起泡，粘性物质多。,发酵液的特点,时间短； 温度低； pH适中（选择在生物物质的温度范围内）； 严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。,对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。,生物分离工程应遵循原则,对产物的要求 保持生物产物的活性 纯度要求高 当生物技术产品是

12、食品或药物时，要求无污染物、无对映体 反应停(thalidomide,酞胺哌啶酮)于1956 年上市, 作为镇静药被广泛应用。1961 年发现(S)-(-)异构体该药具有致畸胎的不良反应。 无病毒 无热原（内毒素） 无致敏原 青霉素抗原决定簇、-内酰胺环,对生产工艺的要求 生物相容性 高纯度 大规模 经济性 清洁性,生物过程开发目标,(1) 产品在最短时间内进入市场 (2) 符合所有安全要求 (3) 工艺成本适当 (4) 可靠 (5) 安全（放大期间安全尤为重要）,某一具体产品的分离提取工艺还与下列情况有关： （1）是胞内还是胞外产物 （2）原料中产物和主要杂质浓度 （3）产物和主要杂质的物理

13、化学特性及差异 （4）产品用途和质量标准 （5）产品的市场价格 （6）不同分离方法的技术经济比较 （7）废液的处理方法等,酿酒、制醋是人类最早通过实践所掌握的生物技术之一。此外，还有酱油、泡菜、奶酒、干酪制作、面团发酵、粪便和秸秆的沤制等。 技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。,经验生物技术时期,第三节 生物分离工程的发展,2. 近代生物技术建立时期第一代生物技术 （19世纪50年代20世纪40年代）,1680年Leenwenhoek通过显微镜观察到细菌； 1857年Pasteur发现了酒精发酵是由活酵母引起的，其他不同的发酵产物则由不同微生物作用而形成发酵生物学

14、理论 1897年Buchner进一步发现破碎的酵母仍能作用产生酒精，将此具有发酵能力的物质称为酶，发酵现象的真相终于开始被人们了解。,这一时期掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段，发酵产物都属于微生物形成的初级代谢产物，诸如：乳酸、酒精、面包酵母、丙酮丁醇、柠檬酸、淀粉酶、蛋白酶。 产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。,柠檬酸,近代生物技术全盛时期第二代生物技术 （20世纪40年代20世纪70年代末）,以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。 无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗

15、生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。 产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。,Alexander Fleming （1928）,美国和英国合作对青霉素进行生产研究（1941年），出现表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基 40u/ml,4. 现代生物技术产品建立和发展时期 第三代生物技术 （20世纪70年代末开始）,两项技术： DNA重组技术(1973年） 细胞融合技术（1975年）,人胰岛素,生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程

16、和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。,一些正在开发或已开始生产的DNA重组技术产品,1988年，日本由40多家公司组建高度分离系统技术研究联合体，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等组建了Biolink公司，加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。 新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术等。,20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步

17、很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：,（1）固液分离技术 （2）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术 （5）其他新型分离技术,发酵液菌体特别是细菌的分离一直是生物工业上的难题。近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。,（1）固液分离技术 （2

18、）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术 （5）其他新型分离技术,细胞破碎是生产胞内物质所必需的技术。已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。,（1）固液分离技术 （2）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术 （5）其他新型分离技术,主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法和有机溶剂沉淀法。双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，

19、在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。,（1）固液分离技术 （2）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术 （5）其他新型分离技术,小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。,（5）其他新型分离技术,超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗

20、透和超滤之间的纳米滤（Nanofiltration）技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。,由于生物分离的复杂性，一般采用多级分离，多种方法协同使用。,第四节 生物分离工程流程,预处理、提取、精制、成品制作： 预处理细胞分离细胞破壁碎片分离提取 精制 成品制作 加热 过滤 匀浆法 离心 沉淀 (重)结晶 浓缩 调 pH 离心 研磨法 双水相 吸附 离子交换 干燥 絮凝 膜分离 酶解法 膜分离 萃取 色谱分离 无菌过滤 超滤

21、 膜分离 结晶 生物工程下游技术一般工艺过程,原料中产品浓度越低，分离纯化的成本越高。 分离纯化的的步骤越多，总收率也越低： 重复提取是提高总收率的一个有效方法： 如谷氨酸一步等电点结晶，结晶母液如再经过一次离子交换提取 75（1 75） 65 91.25 。,（1）原料液的预处理和固液分离 主要技术：过滤和离心 （2）提取（初步分离） 目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件。 可选技术较多：盐析法、有机溶剂沉淀、 化学沉淀、大孔吸附树脂、膜分离技术,生物分离工程的4个阶段及技术,（3）精制（高度纯化） 目的：除去与产物性质差异较大的杂质 通常采用对产物有高度选择性的技

22、术，如色谱分离技术、结晶、重结晶 （4）成品制作 喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶,下游工艺过程取决于产品的性质和要求达到的纯度 如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。 如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。 如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。, 步聚少：降低工序和成本 次序合理：先粗后精、先大后小 产品规格：注射，非注射 生产规模 物料组成 产品形式：固体（适当结晶），液体（适当浓缩） 产品稳定性 物性：溶解度，分子电荷，分子大小，功能团，稳 定性，挥发性 危害性 废水处理,生物下游加工过程的选择准则,生物分离的本质是识

23、别混合物中不同溶质间的物理、化学、生物学性质的差异，利用能识别这些差异的分离介质和扩大这些差异的分离设备，来实现目标组分的分离和纯化。,第五节 生物分离工程的理论基础,物理性质： 力学性质（密度、尺寸、形状）：可以进行重力沉降、离心分离和膜分离。 热力学性质（溶解度、挥发度、表面活性、分配平衡行为等）：可以进行蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附、离子交换等。 传质性质（粘度、分子扩散系数、热扩散现象）：直接应用较少。 电磁性质（电荷特性、电荷分布、等电点、磁性等）：可以进行电泳、电渗析、离子交换、磁分离等。,化学性质 化学热力学（化学平衡）、反应动力学（反应速率）和光化学特性（激光激发作用）

24、化学吸附和化学吸收是利用化学性质进行分离的典型例子，利用激光激发的离子化作用可以进行同位素分离。,下游技术中的化学反应 选择性分离纯化： 如柠檬酸工业中常用钙盐沉淀，以便于与发酵液中残糖及其他可溶性杂质的分离。 利用草酸与Ca2+反应，生成不溶性钙盐可除去杂质Ca2+ 。 产品制造： 氨基酸或短肽能络合或螯合某些金属离子生产保健产品。补充人体缺乏又不易被人体吸收的钙、铁、锌等微量元素。 山梨醇和木糖醇可以通过葡萄糖和木糖经金属镍催化加氢工艺(高压)获得。,生物学性质 生物学性质是生物分离所特有的。利用生物分子的分子识别作用可以进行亲和分离，亲和色谱是典型代表。,亲和色谱 利用某些生物物质之间特

25、异的亲和力进行选择性 分离的色谱技术。,利用酶反应的立体选择性，可以对手性分子进行选择性修饰，增大手性分子间的理化性质差异，为通过常规方法分离手性分子创造条件。,生物分离技术可以分为两大类：平衡分离和差速分离 平衡分离法：根据溶质在两相间分配平衡的差异进行分离，又称为扩散分离。溶质达到分配平衡的推动力取决于系统的热力学性质，即溶质偏离平衡态的浓度差（化学势差），不需要外力。包括蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附、离子交换等。,差速分离法：是利用外力（压力、重力、离心力、电场力、磁力等）驱动溶质迁移，根据产生的速度差进行分离的方法。包括超滤、反渗透、电渗析、电泳等。传统的机械分离（重力沉降、过滤

26、、离心沉降）也属于差速分离范畴。,分离操作,利用目标产物与杂质之间在物理、化学、生物学性质上的差异进行分离。 往往需利用多种分离机理，实施多步分离步骤。,非蛋白类杂质的去除,（1） DNA A.阴离子交换（pH 4.0) B.亲和层析（不被吸附） C.疏水层析 （2）热原 （蛋白质溶液中的去热原） A.生产过程无菌 B.所有层析介质无菌 C.所用溶液无菌 D.亲和层析（多粘菌素） （3）去病毒 A.加热 （60 ) B.过滤 C.灭活剂,蒸馏、蒸发、过滤、离心、结晶和离子交换等适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。 各种新型高效的过滤机

27、械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。,第六节 生物分离工程的发展动态,成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力,一. 对传统分离技术进行提高和完善,二.研究开发新的技术,1）新型分离介质的研究开发 2）子代分离技术 3）其他新兴下游技术 4）下游技术与上游技术相结合,膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。,1）新型分离介质的研究开发 2）子代分离技术 3）其他新兴下游技术,各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术

28、和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。,由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。,1）新型分离介质的研究开发 2）子代分离技术 3）其他新兴下游技术,新兴下游技术 超临界流体萃取Supercritical fluid extraction 反胶团萃取Revised micelle extrac

29、tion 液膜分离Liquid membrane separation 磁性亲和分离magnetic affinity separation 聚焦色谱Chromatofocusing 高速逆流色谱High speed countercurrent chromatography 径向流色谱Radial flow chromatography 连续环状色谱Continuous annular chromatography 拟移动床色谱Simulated moving bed chromatography,4. 下游工程与上游工程相结合,发酵与分离耦合过程的研究 这一新的技术思路在20世纪70年代首先用于厌氧发酵乙醇发酵过程中，取得了令人满意的效果，近年来逐步发展到用于好氧发酵过程中来。 发酵-分离耦合过程的优点是可以解除终产物的反馈抑制效应，同时简化产物提取过程，缩短生产周期，收到一举数得的效果。,三、强化物理化学作用的影响,物理作用 将微波、超声波、电磁等应用于分离： 微波萃取 微波蒸馏 超声波萃取 磁性亲和分离,三、 强化物理化学作用的影响,化学作用 选择适当的分离剂，增大分离因子，增加对目的组分的选择性 向分离体系投入附加组分，改变原来体系的化学位，从而增大分离因子。 无水乙