核磁共振波谱法（NMR）

1、核磁共振波谱法,(nuclear magnetic resonance spectroscopy),（NMR）,核磁共振波谱学定义： 利用原子核的物理性质，采用当代最先进的无线电和计算机技术，研究各种分子物理和化学结构的一门学科。,核磁共振波谱法,NMR概述 基本原理 谱图解析与应用 NMR仪器 二维及多维核磁共振,核磁共振成像（Nuclear Magnetic Resonance Imaging，是利用核磁共振（nuclear magnetic resonnance，简称NMR）原理，依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，即可得知构成这一物

2、体原子核的位置和种类，据此可以绘制成物体内部的结构图像。 将这种技术用于人体内部结构的成像，就产生出一种革命性的医学诊断工具。快速变化的梯度磁场的应用，大大加快了核磁共振成像的速度，使该技术在临床诊断、科学研究的应用成为现实，极大地推动了医学、神经生理学和认知神经科学的迅速发展。,第一章 核磁共振波谱法概述,核磁共振成像的“核”指的是氢原子核，因为人体的约70%是由水组成的，MRI即依赖水中氢原子。当把物体放置在磁场中，用适当的电磁波照射它，使之共振，然后分析它释放的电磁波，就可以得知构成这一物体的原子核的位置和种类，据此可以绘制成物体内部的精确立体图像。通过一个磁共振成像扫描人类大脑获得的一

3、个连续切片的动画，由头顶开始，一直到基部。,右图为人脑纵切面的核磁共振成像,历史,1946年 - Bloch (Stanford U.) 2.12.6; 2.2 3.2; 2.0 2.7; 3.2 4.0, 1H(CH3),(1)烷基：02 ppm (烷烃),B) CH2, 1H(CH2),1.17 3.40 2.47,C) CH,一般比CH2的值大0.3ppm,(2)烯：,一般1Hc最大。,(3)苯环：,无取代基时，,47 ppm (6.5 ppm左右较普遍 ),1H=7.3 ppm, 单峰,A) 单取代,a.烃基单取代,一组峰，分辨不开,b.邻对位定位基单取代,邻对位质子受屏蔽作用，在高场

4、，分辨不开,间位质子在低场，三重峰,c.间位定位基单取代,苯环电子云密度降低,Jab：7 10 Hz ； Jac：2 3 Hz ； Jad：0 1 Hz,邻位质子受去屏作用，大，粗略呈双峰； 其它质子位移不大。,B) 二取代,a.对位二取代,最具特色,四重峰，左右对称,HA = 7.27-0.8+0.3 = 6.77,HB = 7.27+1.0-0.15 = 8.12,o-NO2:1.0; m-NO2: 0.3 o-NH2: 0.8; m-NH2: 0.15,b.邻位二取代,相同取代基时，谱图左右对称,不同取代基时，谱图复杂,c.间位二取代,谱图复杂。中间质子显示粗略单峰。,（4）活泼氢：,值

5、变化大。易受温度、添加重水、 改变溶剂及酸度的影响,醇OH,3.06.0 ppm(CCl4等惰性溶剂),羧酸COOH,1013 ppm,脂肪胺NH2,0.55.5 ppm,常见结构单元化学位移范围,2.6.6 NMR定量分析,峰面积与核的原子数成比例 需知每个质子所产生的峰面积信号大小 缺点： 共振峰重叠多,2.7 辅助谱图分析的方法,2.7.1 使用高频（或高场）谱仪 2.7.2 位移试剂 2.7.3 计算机模拟谱图,2.7.4 重氢交换法 重水 D2O 交换，可判断分子中是否存在活泼 氢及活泼氢的数目。 交换反应速度的顺序：OHNHSH 若分子中含有这些基团，在作完谱图后滴加 几滴重水，然

6、后重新作图，此时活泼氢已被氘取 代，相应的谱峰消失。,2.8 核磁共振13C谱,核磁共振的基本条件 13C核： = 0.67108 rad T-1 s-1 同位素丰度：1.1%, = H0 /2,13C-NMR谱的特点,1.信号弱，灵敏度低,灵敏度：丰度 3,同位素丰度：1.1% (13C) ; 99.9% (1H), (13C) 1/4 (1H),13C-NMR为1H -NMR的1/6000,2.化学位移范围大，对分子内电子状态的细微变化反映灵敏。峰的分辨率高，便于解析。,1H谱：, 015 ppm,1C谱：, 0300 ppm,3.能得到分子骨架结构的信息：,等,2.8.1 13C-NMR

7、谱图参数,1.化学位移,2. 13C-NMR的自旋偶合,13C-1H自旋偶合,去共振偶合方式中，峰的裂分数, 与C相连H的数目。,SP3杂化,四重峰 三重峰 双峰 单峰,2.8.2 13C-NMR谱的测定方法,1.质子去偶法: proton decoupling method,辐照质子的共振区域，去其偶合作用,磁等价13C核只出单峰，信号强度大。,偏共振去偶又称不完全去偶。在做13 C谱时，首先要采用宽带去偶，一般的13C谱都是宽带去偶后的谱图，如果需要了解分子中某些H的情况，就需做偏共振去偶，偏共振去偶就是保持了与13C直接相连H的偶合，远离13C的H的偶合都去掉，用此法可了解直接和C相连的

8、H的个数，以判断CH3,CH2还是CH等。,2.去共振偶合(偏共振去偶)法: off-resonance decoupling method,3.门控去偶法，非NOE方式,NOE: Nuclear overhouser effect,质子去偶法中信号强度的增大随各C原子的 杂化轨道状态及分子环境不同而异，信号强度 不具有定量性。,4.门控去偶法，NOE方式,gated decoupling method,只在观测13C核的期间不辐照1H核,既有自旋偶合，又有强度增大，信噪比大,5.选择质子去偶法,selective decoupling method,对特定官能团的质子进行辐照，对相应13C核

9、进行归属,DEPT法,DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)实验称为无畸变极化转移增强实验。使碳氢多重峰具有正常的强度比和理想的相位，同时用角脉冲，降低了多重峰信号对J值的依赖性。其信号强度仅与脉冲的倾倒角有关，使谱图更直接明了。 是一种一维极化转移脉冲系列，用以确定分子中碳连接氢的数目。如CH3、CH2、CH和C。,利用DEPT序列得到的结果:,当 45时， CH3、CH2和CH的峰均为正峰 90时， 仅出现CH峰 135时， CH3和CH正峰，而CH2为负峰 在DEPT谱中季碳不出现信号,在做DEPT实验时，只要

10、分别设置 倾倒角为45、90和135，做三次实验，就可以区分不同连氢碳原子的类型。,松蒎醇(C10H18O) (a)1H宽带去偶13C谱;(b)DEPT(2=90)谱;(c)DEPT (3=135)谱,第三章 谱图解析与应用,3.1氢谱图谱提供的信息,核磁共振氢谱图能够提供的化合物结构信息 （1）峰的数目：标志分子中磁不等价的质子的种类，多少种 （2）峰的强度(面积)：每类质子的数目(相对)，多少个 （3）峰的位移( )：每类质子所处的化学环境，化合物中位置 （4）峰的裂分数：相邻碳原子上质子数； （5）偶合常数(J)：确定化合物构型。,3.2 氢谱谱图解析,解析步骤：,1.区分溶剂峰，杂质峰

11、和旋转边带峰,2.计算不饱和度,3.根据峰面积积分曲线计算各组峰所对应的氢原子数,5.确认芳香族化合物峰,解析步骤：,6.对简单多重峰进行解析，找出相互偶合的基团,7.将每个峰的化学位移值与表对照，确认官能团及相邻基团,8.根据官能团及其组合方式推出可能的结构,9.对所得结构进行指认,示例-1,例1某未知物分子式为C5H12O，其核磁共振氢谱图如图所示，求其化学结构。,解：从分子式C5H12O求得化合物的不饱和度为零， 故此未知物为饱和脂肪族化合物。未知物的核磁共振谱图中有3个单峰，其积峰高度比为1：2：9（从高场到低场），其中4.1ppm处的宽峰，经重水交换后消失，说明分子中存在羟基。0.9

12、ppm处的单峰相当于9个质子，可看成是连在 同一个碳上的3个甲基。 3.2ppm处的单峰相当于2个质子，对应于一个亚甲基，从其化学位移值可知该亚甲基是与电负性强的基团相连，即分子中存在CH2OH结构单元。因此未知物的结构为,示例-1,例2某化合物分子式为C6H10O3，其核磁共振谱图如图所示，试确定该化合物的结构。,示例-2,解：从化合物分子式C6H10O3求得未知物的不饱和度为2，说明分子中含有C=O或C=C。但核磁共振谱中化学位移5以上没有吸收峰，表明不存在烯氢。谱图中有4组峰，化学位移及峰的裂分数目为4.1ppm（四重峰），3.5ppm（单峰）,2.2ppm（单峰），1.2ppm（三重峰

13、），各组峰的积分高度比为2：2：3：3，这也是各组峰代表的质子数。从化学位移和峰的裂分数可见4.1ppm和1.2ppm是互相偶合,与强拉电子基团相连，表明分子中存在乙酯基（COOCH2CH3),3.50ppm为CH2，2.2ppm为CH3，均不与其它质子偶合，根据化学位移2.2ppm应于拉电子的羰基相连，即CH3-C=O。,示例-2,3.3 13C-NMR谱图解析,解析步骤：,1.找溶剂峰：如CDCl3 = 77.0，三个峰,2.确定信号峰的数目，即分子内非等价C原子的个数,3.确定分裂线的数目： 去共振偶合谱图可得各C原子上连接的H原子数,4.将化学位移分类解析，查表推断相连基团。,解析步骤

14、：, 082 ppm,SP3碳原子, 82160,SP2碳原子, 65100,SP碳原子, 160225,羰基碳原子, 175225 175205 160185 155175 ppm,例1：C6H10O2 的 13C NMR 的数据 （ppm） 14.3 17.4 60.0 123.2 144.2 166.4 谱线多重性 q q t d d s,有六个数据，表明有六种 C，与分子式中 C 的 数目相同，说明 C 没有对称性。,CH3CH2OCOCH=CHCH3,例2：C11H14O2 的 13C NMR 的数据 （ppm） 39.9 55.6 55.7 111.9 112.5 115.5 谱线

15、多重性 t q q d d t （ppm） 120.7 132.7 137.9 147.9 149.4 谱线多重性 d s d s s,有 11 个数据，表明有 11 种 C，与分子式中 C 的 数目相同，说明 C 没有对称性。,第四章 核磁共振波谱仪,1永久磁铁：,2 射频振荡器：,3 射频信号接受器（检测器）,4样品管：,1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。,2 射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。,3 射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏

16、级信号。,4样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转, 磁场作用均匀。,核磁共振波谱仪,200兆超导核磁共振仪,美国 Varian 公司,核磁共振波谱仪,600兆超导核磁共振仪,美国 Varian 公司,核磁共振波谱仪,第五章 二维傅立叶变换核磁共振2D-NMR(Two-dimensional FT-NMR),FID信号数据是时间t2的函数(普通NMR),在获得FID信号之前， 用一周期为t1的脉冲微扰,改变不同t1，重复测定，得到两个频率变量 1和2或化学位移变量 1和 2的二维谱图,1, 3-丁二醇的13C 2D-NMR,二维核磁共振波谱是70年代以来NMR技术所发出的一次革命性的变化。

17、将通常挤在一维NMR谱中的一个频率轴上的NMR谱在二维空间展开，从而较清晰地提供了更多的信息，有利于复杂谱图的解析，使核磁共振技术成为药物分子，天然产物和生物大分子在溶液中结构和动力学性质有效而重要的工具。,一、二维核磁共振的概述,普遍的NMR谱是从吸收强度为纵坐标，以频率（或强度）为横坐标。而二维NMR谱则给出两个频率轴上的吸收强度，两个频率轴可以改变，有时它们分别为化学位移和偶合常数，也可以表示为不同核的共振共振频率。,二维NMR技术可以看成一维NMR的推广,在二维NMR实验中,相当于进行一系列一维NMR实验,只是在激发脉冲之后不是立即就检测,而是等待一段时间t1(t1为变量),然后在t2

18、时刻进行检测。在t1时间可以对磁化矢量施加各种脉冲,改变其状态,使我们感兴趣的信号能被检测出来,同时抑制不需要的信号.,如今二维NMR实验类型已经难以数计，但是可以将它们主要地分为基于偶合的相关转移谱和基于动力学过程的极化转移谱两大类。,在NMR中，横向磁化强度总与相干相联系，纵向磁化强度总与极化相联系。二维谱一定与磁化强度的转移有关，要么是横向磁化强度的转移或相干转移，例如化学位移相关谱COSY等，要么是纵向磁化强度的转移或极化转移，例如化学位移交换谱EXSY等。二维谱的设计关键就是如何实现预定目标的相干转移谱或极化转移谱。,二维相关谱是应用最广泛的二维谱,若在t1，t2期之间存在混合期和混

19、合脉冲,不同核的磁化之间有转移，这种实验得到的是二维相关谱。早期的异核二维相关实验是直接观测13C、15N等不灵敏核，获得的是它们与1H的偶合相关信息。但是因为13C、15N天然丰度极低，NMR信号是非常弱的，测一维谱已经非常困难，二维谱就要占用更长的时间。异核多量子相干(HMQC)实验的出现是NMR中十分重要的进展。在不灵敏灵敏的核的异核偶合系统中，HMQC观测的是灵敏核的FID，而通过核间偶合间接的观测不灵敏核的化学位移，与记录不灵敏核FID的实验相比，信噪比的提高就有了一个飞跃。,虽然HMQC实验成功率很高，但是它无法判定季碳的化学位移。异核多重键相关谱(HMBC)实验弥补了这一缺点。H

20、MBC脉冲序列的基础仍然是HMQC实验，只不过长程偶合常数比单键偶合常数小很多而已。,异核单量子相关谱(HSQC)实验是一种在演化期只涉及单量子相干的逆检测开核相关实验。HSQC的图谱质量要略差于HMQC谱。但是，HSQC谱在F1维的分辨率要比HMQC谱高，这是因为在多量子谱中，量子数越大，谱分辨率越差，尤其在高场仪器中。HSQC实验在三维NMR中得到比HMQC实验广得多的应用。,在国际上广泛流行的分类方法是将二维谱分成分离谱、稳态相关谱和动态相关谱三种。前面提到的分类方法与通常的分类方法有所区别，实际上是将分离谱与稳态相关谱都归于相干转移谱。将二维谱分为相干转移谱和极化转移谱是从物理机制上进

21、行区别的，而从实验的角度看，二维试验又可分为同核和异核实验，复数采样和实数采样实验，用梯度场和不用梯度场实验等等。不管怎样分类，二维谱在仪器操作过程上是有其共性的，不同的二维实验只是脉冲序列不同而已.,尽管NMR在蛋白质分子构象的研究中已经取得了非常重要的成就，然而 NMR的分辨能力有限，遇到分子量较大的蛋白质分子时，NMR技术便无能为力了。,在二维谱技术仍然遇到谱峰重叠问题时，多维谱学技术便应运而生。 多维NMR实验开辟了测试与研究更高分子量生物分子溶液三维结构、解释生物化学现象、以及生物大分子运动状态等的研究领域。发展三维谱不需要任何新的原理，只是对二维谱合乎逻辑的推广。三维NMR谱是在二

22、维NMR谱的基础上加一个时间周期扩展而成，三维实验可看成是两个二维实验的组合。,尽管3D NMR谱的分辨率有所提高，但解释较大的三维异核NMR谱时，仍存在含糊性，因此，人们希望通过增加维数进一步提高分辨率，随之出现了4D NMR谱，4D NMR谱常常是说明2D NMR谱的方法。4D NMR试验可以看成是由三个2D NMR实验所组成。新的4D NMR技术仍在不断发展，并越来越广泛的应用于蛋白质及核酸研究的报道。,二、二维谱图的类型,堆积图 等高线图 单一的一行或一列图 投影图,(1) 堆积图,它是由很多条“一维”谱线紧密堆积而成的,这种图能直观显示谱峰的强度信息,对复杂分子由于信号的堆积而很难找

23、出吸收峰的频率以及被大峰遮盖的小峰,同时,作图耗时较多.,CHCl3的H-H COSY谱 (a) 堆积图; (b) 等高线图,(2) 等高线图,是把堆积图用平行于F1和F2域的平面进行平切后所得。如上页图所示。最中心的圆圈表示峰的位置，圆圈的数目表示峰的强度。等高线图所保留的信息量取决于平切平面最低位置的选择，如果选得太低，噪音信号被选入会干扰真实信号；如果选得太高，低强度的信号被漏掉，不利于谱图的解析。等高线图虽有缺点，但其信号便于指认，绘图时间短，较常采用。, 紫罗兰酮的部分同核H-H J分解谱的平面等高线图,(3) 单一的一行或一列图,它是从二维矩阵中取出一个谱峰（F2域或F1域）所对应

24、的相关峰一维显示形式，对检测一些弱小的相关峰（在二维等高线水准以下的峰）十分有利。,(4) 投影图,是一维谱形式，相当于宽带质子去偶氢谱，可以准确地确定F2域各谱峰的化学位移值。,三、同核氢-氢二维J-分解谱,同核H-H二维J-分解谱,是将原来显示在1D-NMR谱中1H的化学位移上重叠的多重峰都分散在二维平面上，从而把相互作用的自旋核的和J分别显示在不同频率轴上。可在F2域上表示，而在F1域上确定其耦合常数。是准确测定密集1H-NMR谱线耦合常数有效地实验方法。,氢-氢化学位移相关谱(1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy),1H-1H CO

25、SY是指在同一偶合体系中的质子之间的偶合相关谱。主要研究氢的同核偶合体系。不仅提供氢核之间通过成键作用的相互信息，而且还可根据相关信息确定两质子之间的偶合关系。它可由谱中的交叉峰来确认两核之间存在的偶合来确定它们的连接顺序,直观的给出两质子之间的偶合关系,从而简化谱图。特别对相接近的异构物的区分非常有效。,双量子滤波相关谱(Double Quantum Filtered Correlation Spectroscopy),双量子滤波相关谱(DQF-COSY)是多量子滤波相关谱中最重要生系列谱之一。其主要功能是抑制很强的单峰信号(例如：溶剂峰)，减弱对角线上谱峰的强度，有利于对角峰附近交叉峰的解

26、析，分辨率高，但累加时间也较长。,TOCSY,TOCSY类似于COSY,其脉冲序列是把COSY序列中的第二个脉冲和NOESY序列中最后两个脉冲,包括混合时间用一个长射频脉冲取代(由于其有效射频场相当高,通常采用组合脉冲技术获得高的功率.目前采用的是MLEV-17),导致了全部相关-电子强偶合的存在.通过标量偶合的磁化转移非常容易发生,从而提供了自旋系统中偶合关联的信息。,四、异核二维核磁共振波谱,二维异核J-分解谱可以将多重度的信息和化学位移完全分开，并可得到所有的JCH值。谱图上F2域显示13C的化学位移，F1域为JCH偶合的多重峰，裂距为JCH/2(由于使用“门控去偶方式”，F1轴上所有峰

27、之间的裂距是实际偶合常数的一半)。对结构分析特别有用。目前普遍采用的是门控去偶技术，其实质是异核偶合体系的自旋回波。,13C-1H化学位移相关谱,13C-1H化学位移相关谱是把化合物分子中的单键偶合(1JCH)的1H信号与13C信号相关联，对于信号的确认非常有效。它与1H-1H COSY一样是应用最广泛和最重要的两个二维实验技术 。,常规的13C-1H COSY可以得到直接键合的碳和氢之间的偶合关系(1JCH)。从其COSY谱得到的1H谱线的归属，根据相互关系(1JCH交叉峰),就可找到与之相连的13C信号。反之，从一个已知的13C信号，通过它的交叉峰也可找到与之相连的1H信号。,1H检测的异

28、核化学位移相关谱,简称INVERSE实验,Proton Detected Inverse Heteronuclear Proton-Carbon Chemical Shift Correlation)1H检测的异核化学位移相关谱，又称作反转实验(Inverse),它是通过极化转移或多量子相干或多量子滤波用1H间接地检测天然丰度低和低旋磁比自旋核的新技术。其主要优点是大大地提高了C-H COSY谱的灵敏度。但对常规测试13C的时间要长。,HMQC 1H检测的异核多量子相干实验 (1H Detected Heteronuclear Multiple Quantum Coherence),HMBC

29、1H检测的异核多键相关实验 (1H Detected Heteronuclear Multiple Bond Connectivity 或 Long Range Heteronuclear Multiple Quantum Coherence),HMQC和HMBC实验，是近年来新发展起来的1H检测的异核化学位移相关的重要实验。实际上，任何一种异核磁化转移都包含着多量子相干，只要两个核(例如1H和13C)之间具有弱偶合就可以用间接检测的方法把产生的异核多量子相干转化成单量子相干来测定。这两个实验都是通过异核多量子相干，用1H间接检测低自然丰度和低旋磁比的核(如13C、15N和113Cd等)，实验

30、的灵敏度很高。,由于Inverse实验的1H测试灵敏度很高(其测试时间可节约数10倍)，它大大提高了异核C，H相关二维实验的灵敏度。对同一个样品做HMQC或HMBC实验时，其灵敏度可以提高千个数量级，时间节省约100倍(相当于浓度降低10倍)。因此比常规的C，H COSY， COLOC和INADEQUATE实验具有明显的优势。这足以抵消使用inverse探头做一维13C谱时由于灵敏度降低所带来的缺点。可见HMQC和HMBC对分子量大而样品量少的样品是极为适宜的，由于这两类实验需要添置Inverse探头和相应的硬件，正在逐渐变成常规测试手段。,异核接力相干转移谱,又称RCT谱(Heteronuc

31、lear Relayed Coherence Transfer Spectroscopy)13C-1H Relay谱其灵敏度虽比C-H COSY谱低,但比2D-INADEQUATE高得多，可作为异核C-H COSY谱的补充，它能够给出分子骨架C-C连接的信息，对于谱峰重叠较为严重的氢的NMR谱更能发挥其作用。,五、NOE 实验(The Nuclear Overhauser Effect),NOE效应是指核的弛豫问题，当以某种方式干扰一个跃迁谱线时，与此核有偶极-偶极作用的另一核的跃迁谱线强度发生了变化，这一现象称为NOE效应。偶极-偶极弛豫作用的强度随核间距的增加而减少，与化学键的数目无关。N

32、OE增强效应的实验分为一维NOE差谱和二维NOESY谱两种。,NOE强度与核间距的差异是稳态的NOE效应。而质子间借助于交叉弛豫完成的磁化转移的二维实验成为NOESY谱。实际上是瞬态的NOE实验。通过NOE和NOESY实验的研究，可获得偶极-偶极偶合信息最终与核间距分子运动的相互关联，研究分子的立体结构，是提供和确定化学交换和空间关系的有力工具。,第六章 仪器分析法联用,多谱综合解析,6.1 各种图谱解析的主要着眼点 1. 质谱（MS） （1）从M.+分子量 （2）从(M+2)/M、（M+1)/M查贝农表，估计C数 （3）从M、M+2、M+4Cl、Br、S （4）氮律 （5）主要碎片离子峰官能

33、团,2. NMR （1）积分曲线H个数 （2）化学位移各类质子 （3）从偶合裂分各基团的相互关系 （4）判断活泼H加D2O,3. IR 判断各种官能团 （1）含O: （2）含N: （3）芳环取代 （4）炔、烯类型,4. UV （1）共轭体系、发色团 （2）从B带精细结构苯环的存在,6.2波谱综合解析的一般步骤,分子量和分子式的确定 分子量：确定质谱图中的分子离子峰 分子式： 质谱： 同位素离子峰强度计算或查阅Beynon表 综合利用各谱学提供的信息： H原子数：从1H NMR的积分曲线高度确定H原子的种类和数目 杂原子数：从红外、质谱及核磁共振谱确定O、N、Cl、Br、S等杂原子种类及数目 C原子数：由13C得到C原子数或 元素分析,计算不饱和度